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探讨缺氧条件下肝癌细胞BEL7402中VEGF是否诱导高表
时间:2017-06-25
GEGF是一种重要的血管生长因子[1]，近来有文献报道说VEGF在缺氧条件见被诱导高表达[2]。其机制可能是在缺氧条件下HIF1a诱导了VEGF的表达[3]。本研究目的是运用RT-PCR验证在缺氧条件下肝癌细胞BEL7402中VEGF是否是诱导高表达的。
1、材料与方法
1.1、一般材料
DMEM+10%的胎牛血清，Trizol，逆转录试剂盒，BIO-RAD荧光定量PCR仪，BEL7402，Olympus荧光显微镜，Therom CO2培养箱，氯仿无水乙醇。
1.2、方法
在缺氧条件下（1% O2，5% CO2and 94% N2，at37℃）培养BEL7402，24 h后从培养箱中拿出，提取细胞总RNA。正常氧气培养作为对照，每次实验做三个复孔，重复三次实验。对于复杂的RNA模板，为了获得更高的合成效率，建议将RNA模板、引物、RNase-free Water 混匀，65℃孵育5min后，冰浴2 min，然后再加入其它反应组分。
逆转录体系：Total RNA 50ng-5ug（2ug），OligoDT18 1ul，Random Primer 1ul， 2X ESReaction Mix 10ul ，EasySoript Enzyme Mix 1ul，gDNA Remover 1ul，R-Nase-Free Water to20ul轻轻混匀，25℃孵育10 min后，42℃孵育30min 85℃加热5 min，4℃保存。定量PCR体系：2X SYBR GREEN BUFFER 5μL，Passive Reference Dye 0.2uL，Forward primer 0.5uL，Reverseprimer 0.5uL，模板1.0μL，R-Nase-Free Water to20ul2、结 果。
RT-PCR验证VEGF的表达量表明，在缺氧条件下，VEGF被诱导高表达。RT-PCR的溶解曲线。见图一。RT-PCR的统计结果用CT= 2-（DDCt）。见图二。
图一 图二
3、讨 论
血管生成因子有HIF1a、VEGF、ADM等[4-5]，在缺氧的条件下有文献报道说HIF1a诱导了VEGF和ADM的大量表达，从而引起一系列的应激反应。本研究验证了肝癌细胞BEL7402在缺氧条件下培养24 h后VEGF的表达是升高的。
本研究证明在肝癌细胞中缺氧培养可以诱导血管的生成，从而加快了肿瘤的生长，促进了肿瘤的侵袭和转移。从这方面分析，降低VEGF或者可以对治疗肝癌或者实体肿瘤有一定帮助。
参考文献
[1] Uemura M, Yamamoto H, Takemasa I, Mimori K, Mizushima T,Ikeda M, Sekimoto M, Doki Y and Mori M. Hypoxia-inducible adrenomedullin in colorectal cancer. ANTICANCER RES. 2011;31(2):507-514.
[2] Liu AG, Zhang XZ, Li FB, Zhao YL, Guo YC and Yang RM. RNA interference targeting adrenomedullin induces apoptosis and reduces the growth of human bladder urothelial cell carcinoma.MED ONCOL. 2013; 30(3):616.
[3] Lee DC, Sohn HA, Park ZY, Oh S, Kang YK, Lee KM, Kang M, Jang YJ, Yang SJ, Hong YK, Noh H, Kim JA, Kim DJ, Bae KH, Kim DM and Chung SJ, et al. A lactate-induced response to hypoxia. CELL. 2015; 161(3):595-609.
[4] Wouters BG and Koritzinsky M. Hypoxia signalling through mTOR and the unfolded protein response in cancer. NAT REV CANCER. 2011; 8(11):851-864.
[5] Zhang Z, Yan J and Shi H. Role of Hypoxia Inducible Factor 1 in Hyperglycemia-Exacerbated Blood-Brain Barrier Disruption in Ischemic Stroke. NEUROBIOL DIS. 2016.
