霍山铁皮石斛活性成分研究及药用价值

时间:2019-10-13

摘要

　　石斛为常用中药，我国76种石斛中约有40种为药用石斛，其药用历史十分悠久，在我国最早的药学专着《神农本草经》中，就记载了石斛“除痹，下气，补五脏虚劳，羸瘦，强阴。久服厚肠胃，轻身延年”。2015版《中国药典》收载了其中金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛、铁皮石斛4个品种，其中铁皮石斛为药典中单独一项。铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo）的干燥茎，是药食两用的名贵药材之一，具有独特的药用价值。铁皮石含有多糖、黄酮、生物碱、菲类、联苄类、氨基酸等多种活性成分，现代研究表明，铁皮石斛有抗氧化、抗肿瘤、调节免疫力、缓解疲劳、治疗糖尿病等药理作用。铁皮石斛目前主要分布在中国安徽、浙江、福建等地。其中安徽霍山的生长条件非常的苛刻，所产的铁皮石斛又称为万丈须。霍山铁皮石斛作为安徽省道地药材一直倍受社会各界的关注，为历代医家所推崇，是药用石斛中的上品，近年来关于霍山铁皮石斛的研究渐为盛行。本文从HPLC指纹图谱，相似度评价，聚类分析等方面对霍山铁皮石斛，其他产地铁皮石斛，以及其他品种石斛药材进行了比较，为铁皮石斛品质鉴别，质量控制及资源的综合利用提供参考；同时通过LC-MS等方法分析霍山产四种石斛的化学成分。建立了石斛类药材总黄酮、多糖、柚皮素和石斛酚成分的含量测定方法，分析石斛类药材样品成分含量。对霍山铁皮石斛不同极性部位进行免疫调节活性筛选，抗氧化活性筛选，为进一步研究霍山铁皮石斛活性成分提供参考，为霍山铁皮石斛产品开发应用提供科学依据。主要研究内容如下：

　　1、不同产地铁皮石斛甲醇提取物指纹图谱研究。建立了不同产地铁皮石斛甲醇提取物HPLC指纹图谱，共确定了12个共有峰，霍山铁皮石斛的共有峰总面积较高，对其进行SPSS聚类分析，结果显示铁皮石斛样品可以分为两类，5批霍山铁皮石斛为一类，其他产地铁皮石斛为一类。指纹图谱相似度分析结果显示，与霍山铁皮石斛的对照指纹图谱对比，5批霍山铁皮石斛的相似度极高，在92.6%-94.8%之间，说明霍山铁皮石斛之间没有较大差异；临安、乐清、盐城、云南所的铁皮石斛相似度在17.5%-41.5%之间，表明不同产地的铁皮石斛HPLC指纹图谱存在一定的差异，霍山铁皮石斛与其他铁皮石斛相比，共有峰面积较高，具有一定的特殊性。主成分分析显示铁皮石斛样品可分为两类：五批霍山铁皮石斛为一类，其他产地铁皮石斛为一类。主成分分析结果与聚类分析结果一致。

　　2、霍山产四种石斛甲醇提取物HPLC指纹图谱研究及LC-MS成分分析。以霍山铁皮石斛作为对照图谱，研究了石斛类药材甲醇提取物的HPLC指纹图谱，并对其进行了相似度研究。结果显示霍山产的铜皮石斛、霍山石斛、河南石斛与霍山铁皮石斛的相似度较高，共有32个共有峰。通过LC-MS分析，初步鉴定了其中13个化合物，分别是2,4,7-三羟基-9,10-二氢菲、N-p-香豆酰酪胺、反-N-(4-羟基苯乙基)阿魏酸酰胺、3,4′5-三羟基-3′-甲氧基联苄、DendrocandinC、柚皮素、二氢松柏醇二氢对羟基桂皮酸酯、（R）-3,4-二羟基-5,4′,α-三甲氧基联苄、尿苷、4′,5-二羟基-3,3′-二甲氧基联苄、3,4′-二羟基-5-甲氧基联苄、3,4-二羟基-5,4′-二甲氧基联苄、Denbinobin。采用SPSS聚类分析法进行分析，结果显示石斛样品可以分为两类，5批霍山铁皮石斛为第一类，其他石斛为第二类，第二类中铜皮石斛、霍山石斛、河南石斛各聚为一类。指纹图谱相似度分析结果显示，与霍山铁皮石斛的对照指纹图谱对比，铜皮石斛，霍山石斛，河南石斛与霍山铁皮石斛的相似度在73.0%-80.7%之间，表明铜皮石斛、霍山石斛、河南石斛与霍山铁皮石斛之间有一定的相似性。主成分分析显示四种石斛样品可分为四类：霍山铁皮石斛为一类，铜皮石斛为一类，霍山石斛为一类，河南石斛为一类。主成分分析结果与聚类分析结果一致。

　　3、石斛类药材中柚皮素、石斛酚、总黄酮、多糖含量分析。采用高效液相色谱法法测定了不同产地铁皮石斛，霍山产铜皮石斛、霍山石斛、河南石斛以及金钗石斛、鼓槌石斛、流速石斛和紫皮石斛中柚皮素、石斛酚成分含量的。霍山产铁皮石斛中柚皮素含量高于其他产地铁皮石斛。其中石斛酚仅在5批霍山铁皮石斛以及霍山产铜皮石斛、霍山石斛、河南石斛、鼓槌石斛中检测到，其他产地铁皮石斛中石斛酚含量太低没有检出。采用紫外分光度法测定石斛类药材中总黄酮成分含量。12批铁皮石斛样品中，5批霍山铁皮石斛的总黄酮含量较高，为3.93～4.48mg/g，其他产地铁皮石斛总黄酮含量为0.79～2.13mg/g。采用2015版中国药典铁皮石斛多糖测定方法测定石斛类药材中多糖成分含量。12批铁皮石斛样品中，5批霍山铁皮石斛的多糖含量较低，为150.37～239.41mg/g，来自其他产地生产基地的铁皮石斛多糖含量为279.47～403.22mg/g。霍山所产的铁皮石斛在野生条下生长，所以多糖含量较低，总黄酮、柚皮素、石斛酚等小分子成分含量较高。

　　4、霍山铁皮石斛不同极性部位体外抗氧化及促免疫细胞增殖活性研究。采用DPPH自由基清除能力测定、还原力测定、·OH自由基清除能力测定和总抗氧化能力测定方法，研究霍山铁皮石斛不同极性部位的抗氧化活性。霍山铁皮石斛正醇部位和乙酸乙酯部位具有较好的DPPH自由基清除能力，仅次于Vc。其中乙酸乙酯部位>正丁醇部位。霍山铁皮石斛不同极性部位还原能力为：正丁醇部位>乙酸乙酯部位>总水提物>剩余水部位>粗多糖。霍山铁皮石斛不同极性部位总抗氧化能力：正丁醇部位>乙酸乙酯部位>剩余水部位>总水提物>多糖。霍山铁皮石斛正丁醇部位的·OH清除能力比较明显。

　　采用MTT法测定霍山铁皮石斛各部位促进巨噬细胞ANA-1增殖作用，结果显示总水提物在浓度为400μg/mL时，能显着促进巨噬细胞ANA-1的增殖，当浓度过高时，其生长会受到抑制；粗多糖在作用浓度为400μg/mL，600μg/mL时，能显着促进巨噬细胞ANA-1的增殖；霍山铁皮石斛乙酸乙酯部位在作用浓度为25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL时，能显着促进巨噬细胞ANA-1的增殖，当浓度过高时，其生长会受到抑制；正丁醇部位各浓度都能显着促进巨噬细胞的增殖，其中100μg/mL时，促进增殖效果最显着；剩余水部位在作用浓度为100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL时，能显着促进巨噬细胞的增殖，当浓度过高时，其生长会受到抑制。

　　关键词：石斛，指纹图谱，化学成分，抗氧化，免疫活性

　　ABSTRACT

　　Dendrobium is commonly used traditional Chinese medicine. There are 76 kinds ofDendrobiums in China, about 40 kinds of them are medicinal Dendrobiums. Themedicinal history of Dendrobium is very long. China's first pharmaceutical monograph"Shen Nong's Materia Medica", there are Dendrobium " Remove the paralysis, loweadverse energy, make up the five dirty consumptive, thin and weak, nourishing kidneyyin. Long-term consumption can be thick stomach, light body and longevity. The 2015edition of "Chinese Pharmacopoeia" contains 4 varieties of Dendrobiums, Dendrobiumnobile Lindl., Dendrobium chrysotoxum Lindl., Dendrobium fimbriatum Hook. anDendrobium officinale Kimura et Migo, among which Dendrobium officinale isseparately listed in the Pharmacopoeia. Dendrobium officinale, the dry stem ofOrchidaceae plant Dendrobium officinale Kimura et Migo, which is one of the raremedicinal herbs in China with unique medicinal value. Dendrobium officinale containspolysaccharides, flavonoids, alkaloids, phenanthridines, bibenzyls, amino acids andother active ingredients. Modern research shows that Dendrobium officinale hasanti-oxidation, anti-tumor, regulating immunity, relieving fatigue, treating diabetes andother pharmacological effects. Dendrobium officinale are mainly distributed in Anhui,Zhejiang, Hunan and Yunnan in China. Among them, Dendrobium Officinale Kimura etMigo in Huoshan is also called ‘wanzhangxu’, which has been paid much attention bycommunity as the authentic medicinal materials of Anhui Province, it is also regarded asthe top grade of Dendrobium by ancient researchers.

　　In this paper, Huoshan Dendrobium officinale, Dendrobium officinale from otherareas and other varieties of Dendrobiums were compared in terms of HPLCfingerprinting, similarity evaluation and cluster analysis to provide reference for thequality identification, quality control and comprehensive utilization of resources ofDendrobium officinale. At the same time, the chemical constituents of four species ofDendrobium from Huoshan were analyzed by LC-MS and other methods. A method forthe determination of total flavonoids, polysaccharides, naringenin and dendrobrin indifferent Dendrobium samples was established, and the contents of differentDendrobium samples was analyzed. On the different parts of Huoshan Dendrobiumcandidum immunomodulatory activity screening, screening of antioxidant activity, toclarify the Huoshan Dendrobium officinale immunomodulatory material basis forfurther study provide a reference.

　　The main research contents are as follows:

　　1, Fingerprints of Dendrobium officinale from different areas. The HPLCfingerprinting of methanol extract of Huoshan Dendrobium officinale from differentareas was established, and a total of 12 common peaks were identified. The total peakarea of Huoshan Dendrobium officinale was higher. SPSS cluster analysis showedthat Huoshan Dendrobium officinale samples could be divided into two types , 5 batchesof Huoshan Dendrobium officinale as a category, other areas of Dendrobium officinalefor a class. Fingerprint similarity analysis showed that the similarity of HuoshanDendrobium officinale to common mode was very high, ranging from 92.6% to 94.8%,indicating that there was no significant difference between Huoshan Dendrobiumofficinale. The similarities of Dendrobium officinale from Lin'an, Yueqing, Yanchengand Yunnan were between 17.5% and 41.5%, indicating that there were somedifferences in the HPLC fingerprints of Dendrobium officinale from different areas.Huoshan Dendrobium officinale had certain peculiarities compared with otherDendrobium officinale. Principal component analysis showed that Dendrobiumofficinale samples could be divided into two types: five batches of HuoshanDendrobium officinale as one species and other Dendrobium officinale as other species.The principal component analysis results are consistent with the cluster analysis results

　　2, HPLC fingerprints and LC-MS analysis of methanol extracts of four kindsof Dendrobium from Huoshan. Taking the samples of Huoshan Dendrobium officinaleas the reference, the HPLC fingerprints of different species of Dendrobium officinalemethanol extract were studied and the similarity was studied. The results showed thatthe similarities between Huoshan Dendrobium officinale, Dendrobium moniliforme, Dendrobium huoshanense and Dendrobium henanense from Huoshan were higher.HPLC fingerprint of four species of Dendrobium chrysanthum from Huoshan wasestablished. By LC-MS comparison, a total of 32 common peaks were identified.Thirteen common compounds were identified, which were 2,4,7-trihydroxyP h e n a n t h r o l i n e , t r a n s - N - ( 4 - h y d r o x y p h e n et h y l ) f e r u li c a ci d ami d e ,3,4'5-trihydroxy-3'-methoxybibenzyl , Dendrocanin C, Naringenin, DihydrocortisoneDihydroxycinnamic Acid Ester, (R) -3,4-Dihydroxy-5,4 ', α-Trimethoxybibenzyl,Uridine, 4' Dihydroxy-3, 3'-dimethoxybibenzyl, 3,4'-dihydroxy-5-methoxybibenzyl,3,4-dihydroxy-5,4'-dimethoxydi Benzyl, Denbinobin. The results of SPSS clusteranalysis showed that Dendrobium samples could be divided into two types, five batchesof Huoshan Dendrobium officinale were the first type, the other dendrobium was thesecond type, the second type was Dendrobium moniliforme, Dendrobium huoshanenseand Dendrobium henanense. Fingerprint similarity analysis showed that the similarity ofDendrobium moniliforme, Dendrobium huoshanense and Dendrobium henanensebetween 73.0% -80.7% in comparison with the common pattern of HuoshanDendrobium officinale. It showed that the four kinds of Dendrobium from Huoshanhave some similarities. Principal component analysis showed that Dendrobiumofficinale samples could be divided into four categories: Dendrobium moniliforme, Dendrobium huoshanense and Dendrobium henanense and Dendrobium officinale. Theprincipal component analysis results are consistent with the cluster analysis results.

　　3, Analysis of naringenin, gigantol, total flavonoids, polysaccharide content ofdendrobium herbs. HPLC-UV method was used to determine the content of naringeninand gigantol in Dendrobium officinale from different areas, Dendrobium moniliformeDendrobium huoshanense and Dendrobium henanense from Huoshan, Dendrobiumnobile, Dendrobium chrysotoxum, Dendrobium fimbriatum, Dendrobium devoninumHuoshan Dendrobium officinale in the content of naringenin and gigantol more thanother Dendrobium officinale. Gigantol was detected only in 5 batches of HuoshanDendrobium officinale and Dendrobium moniliforme, Dendrobium huoshanense, Dendrobium henanense from Huoshan. Determination of total flavonoids in differentDendrobium by UV spectrophotometry. five batches of Huoshan Dendrobium officinalehad higher total flavonoids content of 3.93-4.48 mg / g in the 12 batches of Dendrobiumofficinale, and the others was 0.79-2.13 mg / g. Determination of polysaccharides indifferent Dendrobium by UV spectrophotometry. In the 12 batches of Dendrobiumofficinale samples, the polysaccharide content of five batches of Huoshan Dendrobiumofficinale was very low, ranging from 150.37 to 239.41 mg / g and the polysaccharidescontent of Dendrobium officinale from other producing areas was 279.47 to 403.22 mg /g. The quality of Dendrobium officinale polysaccharides cultivated and produced in theplanting base was generally higher than that of the wild herbs, and the breeding ofDendrobium officinale increased the polysaccharide content. The Huoshan Dendrobiumofficinale grown in wild conditions, so the polysaccharide content is low, the totalflavonoids, naringenin, gigantol and other small molecule content higher.

　　4, Study on antioxidation and proliferation activity of immune cells in vitro ofdifferent extraction parts of Huoshan Dendrobium officinale. DPPH free radicalscavenging ability determination, · OH radical scavenging ability determination,reducing force performance determination and total antioxidant activity determinationmethod were used to study the antioxidant activity of various parts of HuoshanDendrobium officinale in vitro. N-butanol and ethyl acetate sites of HuoshanDendrobium officinale have good DPPH scavenging capacity, second only to Vc, whereethyl acetate> n-butanol site. Huoshan Dendrobium officinale restoreability of variousparts of the body: n-butanol> ethyl acetate> total water extract> residual water> crudepolysaccharide. Total antioxidant capacity of Huoshan Dendrobium officinale:n-butanol> ethyl acetate> remaining water> total water extract> polysaccharide. · OHscavenging capacity of Huoshan Dendrobium officinale more obvious.

　　MTT assay of various parts of Huoshan Dendrobium officinale promote theproliferation of ANA-1, the results showed that the water extract at a concentration of400 μg / mL, can significantly promote the proliferation of ANA-1, when theconcentration is too high, its growth will be inhibited ; Crude polysaccharide at theconcentration of 400 μg / mL, 600 μg / mL, can significantly promote the proliferationof ANA-1; Huoshan Dendrobium officinale ethyl acetate in the role of the concentrationof 25 μg / mL, 50 μg / mL, 100 μg / mL can significantly promote the proliferation ofANA-1, when the concentration is too high, its growth will be inhibited; n-butanolconcentration of each site can significantly promote the proliferation of ANA-1, ofwhich 100 μg / mL, promote proliferation The most significant effect; the remainingwater site at the concentration of 100 μg / mL, 200 μg / mL, 400 μg / mL, cansignificantly promote the proliferation of ANA-1, when the concentration is too high, itsgrowth will be inhibited.

　　Key words: Dendrobium, Fingerprinting, Chemical composition, Antioxidant, Immune

目录

　　第一章绪论

　　石斛为常用中药，我国76种石斛中约有40种为药用的石斛，其药用历史十分悠久，在中国最早的药学专着《神农本草经》中，就记载了，石斛“除痹，下气，补五脏虚劳，羸瘦，强阴，久服厚肠胃，轻身延年”[1]。2010版与2015版《中国药典》收载了其中金钗石斛，鼓槌石斛，流苏石斛，铁皮石斛4个品种[2]，其中铁皮石斛为药典中单独一项。

　　铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)的干燥茎，具有益胃生津，滋阴清热等功效[2]，是我国药食两用的名贵药材之一。最早记载石斛的药学专着为东汉末年的《神农本草经》，就将其归类为上品。目前铁皮石斛主要分布在我国安徽省霍山县大别山、云南（广南、石屏、文山）、浙江（临安、富阳、鄞县、天台）、广西（宜山、西林、天峨）以及四川（汉源、甘洛、金阳）等地[3]。历代本草中将霍山作为石斛的产地[4]，生长于霍山的石斛品质最佳。现代文献报道[5-8]，铁皮石斛还具有抗氧化、提高免疫力、抗衰老等生物活性。

　　1.1铁皮石斛的研究概况

　　1.1.1铁皮石斛的指纹图谱研究

　　高效液相色谱法（HPLC），是目前在中药材品质控制中较常用的分析方法。目前，已有通过HPLC指纹图谱对广西、安徽、云南、浙江等地的铁皮石斛进行了品质研究。李杰[9]收集了不同产地的铁皮石斛鲜条以及市场购买的干品，对其进行HPLC指纹图谱研究，比较不同铁皮石斛样品品质的差异。肖正杭[10]，采用高效液相色谱法对10个产地铁皮石斛药材的茎和叶片进行了HPLC指纹图谱研究，同时测定主要活性成分的含量。该方法非常简便，结果准确，可作为铁皮石斛药材质量控制的有效手段。裂解色谱是20世纪60年代发展起来的一种快速分离检测技术。此法使供试品在设定好的高温条件下裂解，将生成的裂解产物用气相色谱进行分析，使用该方法得出的指纹图谱，谱图重现性好。王丽丽[11]等使用裂解气相色谱研究了不同产地的铁皮石斛的指纹图谱。红外光谱方法能够给出被测物所含官能团的信息，在药材定性鉴别中有其独特优势。李莹[12]等通过红外光谱对石斛类药材的指纹图谱进行研究，发现了石斛类药材之间的异同点，得出结论可通红外指纹图谱对石斛类药材进行分析鉴定。随着分子生物学的迅猛发展，各种DNA分析技术被使用的也越来越多。DNA指纹图谱对研究植物药育种，分析药材种质亲缘关系，鉴别药材品种等方面都有很大的意义。虞泓[13]等通过DNA指纹图谱的方法对不同石斛药材进行研究，认为AFLP分子标记技术在可以用于石斛道地性研究。1H-NMR指纹图谱可以反映中药药总提物特征性化学成分的结构和相对组成方式。秦海林[14]等通过1H-NMR指纹图谱对不同产地的环草石斛进行了研究，研究结果显示，不同产地样品，不同采收时间的样品的特征性化学成分在结构和相对组成方面是一致的，说明该方法准确，稳定。

　　1.1.2铁皮石斛的化学成分研究

　　1.1.2.1多糖

　　李满飞[15]测定了收集到石斛的多糖含量，研究结果显示，不同石斛的多糖含量差异较大，最低的仅为6.20%，而最高的可达到45%，但大多数石斛多糖含量都大于百分之三十。于力文等[16]对安徽产的铁皮石斛、铜皮石斛和霍山石斛不同时期的根茎叶的多糖含量进行了测定，研究结果表明霍山石斛茎中的多糖含量最高，在不同时期都高于其他两种石斛；根茎叶之间多糖含量的变化也非常有规律，基本都是叶≥根≥茎，说明在石斛的叶片和根中也有较高的多糖含量。陈立钻[17]通过对机械加工与手工加工进行对比，认为通过机器对石斛药材进行加工，基本不会影响药材的品质。张雨婷等[18]对铁皮石斛的干燥方法进行了研究，研究结果表明，传统的烘干工艺与加工方法会让铁皮石斛的品种收到影响，通过对烘干，红外、微波、真空冻干四种方法进行干燥，发现冻干对铁皮石斛品种影响最小。王琦[19]等对不同采收时期铁皮石斛的多糖含量进行了分析，发现。黄丽等[20]对铁皮石斛多糖的提取工艺进行了研究，并且测定了云南省普洱、宝山。景洪、红河等地的多糖含量，结果显示景洪勐龙的多糖含量最高。邵尉等[21]研了光照以及采收时间对铁皮石斛多糖类成分含量的影响，结果显示多糖含量随着光照的增加而增加，光照对还原糖的含量几乎没有影响。甘露糖对光照需求不大，在单层遮阴网条件下，含量最大。诸燕[22]等报道，生产基地种植的铁皮石斛药材多糖含量高于野生环境下生长的石斛。李岩[23]等研究了酶法提取对铁皮石斛多含量的影响，结果发现在提取时使用α-L-鼠李糖苷酶可以增加铁皮石斛多糖的提取率。Wei等[24]将对铁皮石斛粗多糖进行分离，分出的两个组分，一个为甘露糖，一个为葡萄糖。

　　1.1.2.2生物碱

　　张明[25]等测定了不同产地金钗石斛生物碱的含量，实验结果显示人工栽培石斛生物碱含量高。有研究发现[26]铁皮石斛在同一生长时间内茎上部的生物碱含量最高，其次是茎中部与下部。尚喜雨[27]研究了不同来源铁皮石斛药材根，茎，叶的生物碱含量，结果表明茎上段的含量较高，一年生的含量较高；自然晒干的铁皮石斛，茎上段和根部的石斛碱含量大于杀青烘干处理的，茎中下段和叶等他部位的生物碱含量则低于烘干的，总生物碱变化较小。徐云燕等[28]比较了不同生长年限采收时期铁皮石斛与金钗石斛生物碱含量的差异，结果显示一年生金钗石斛的生物碱含量最高，生长年限越长，生物碱含量降低，铁皮石斛中生物碱含量很低。除了采收时间、生长年限，药材部位和种质也会对石斛中生物碱含量产生影响。Xu等[29]研究了采收的时间对铁皮石斛中生物碱含量的影响，对不同生长年限的铁皮石斛药材进行了生物碱含量测定，结果显示，一年生铁皮石斛生物碱含量最高。YuanL等[30]研究或铁皮石斛生物碱的提取工艺，结果显示当提取条件为料液比：1:30，32U/g的纤维素，39200U/g的木瓜蛋白酶和2.5h的水解时间时，提取效果最好，生物碱的提取率为0.136％，纯度为78.2％。汪群红等[31]比较3种不同来源的铁皮石斛，发现石斛组培品生物碱量最高，有研究表明[32]，对铁皮石斛的类原球茎进行光照培养，在500lx强度下，生物碱含量最高。

　　1.1.2.3黄酮类

　　物质黄酮类成分是铁皮石斛中多种活性成分之一。吴佳雯[33]研究显示，乐清市个厂家的铁皮石斛总黄酮含量分别为0.050%、0.068%、0.077%。黎晶晶[34]采用高效液相色谱法对铁皮石斛的黄酮类成分，芹菜素-6，8-二-C-β-D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷、异夏佛托苷、夏佛托苷、芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-木糖苷和柚皮素进行了含量测定。

　　1.1.2.4氨基酸

　　研究表明铁皮石斛中含有七种人体必需氨基酸，徐兰芳[35]等研究了生长在不同树种上铁皮石斛的氨基酸含量差异，结果表明铁皮石斛生长在不同树种上时，氨基酸的含量会有差异。有研究表明[36]铁皮石斛中氨基酸含量在第三年达最高。此外，对铁皮石斛进行品种选育，或者延长铁皮石斛的成长期等方法可增加铁皮石斛中氨基酸的含量。

　　1.1.2.5菲类和联苄类

　　菲类和联苄类是对均二苯乙烯母核或其聚合物的总称。近年来，芪类化合物的药理活性已经引起药理学家和天然药物化学家的重视。芪类具有抗血小板凝聚、免疫调节、抑菌、抗氧化、抗肿瘤、降血脂等多种生物活性，逐渐引起人们的重视[37]。从铁皮石斛中分离鉴定的芪类化合物有：双苄酚类及菲酚类化合物毛兰素和鼓槌菲[38]；菲醌母核类化合物菲醌；铁皮石斛素A、铁皮石斛素B、铁皮石斛素C、铁皮石斛素D和DendrocandinE、石斛酚（gigantol）等[39]。Lin等[40]通过对石斛的茎进行分离，得到了十二种菲类化合物。李榕生等[41]对铁皮石斛的提取物进行气相质谱分析，鉴定出6个菲类化合物。包晓青[42]等对铁皮石斛中的四个芪类成分进行了分离，并进行了含量测定，其中3,4-二羟基-5，4’-二甲氧基联苄含量最高，各个种植基地的铁皮石斛中芪类成分含量有区别。陈晓梅等[43]发现石斛酚是石斛属中最主要的联苄类成分。与Yang[44]等认为菲类和联苄类成分含量与铁石斛的种龄正相关。

　　1.1.2.6微量元素

　　铁皮石斛中有多种人体所需的微量元素，如K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn等。张桂玲[45]对两种铁皮石斛不同部位中的多种微量元素进行了含量测定，结果表明叶中的各元素含量比茎中的高。魏静[46]对海南与浙江产的铁皮石斛进行了微量元素的研究，发现两种铁皮石斛都含有多种人体必需矿物质，K、Mg、Ca和P的含量都较高，海南产铁皮石斛中微量元素的含量要高于浙江产的铁皮石斛。

　　1.1.3铁皮石斛的药理活性研究

　　1.1.3.1抗肿瘤活性

　　Fan等[47]从铁皮石斛中分离出三个组分多糖，发现其中一个组分DDP1-1对抑制肿瘤细胞增生有很强的功效。郑秋平等[48]从对铁皮石斛不同极性部位进行了抗肿瘤活性的研究，并对化合物进行了分离，结果显示，铁皮石斛对肝癌、胃癌和乳腺癌细胞都有一定的抑制活性。Bai等[49]将发现分离得到的铁皮石斛多糖组分对人乳腺癌细胞有抑制活性。有研究发现其中柚皮素等联苄类化合物对部分癌症细胞有一定抑制作用[50]。

　　1.1.3.2提高免疫力

　　李伟等[51]研究发现铁皮石斛可以增强免疫抑制模型小鼠的免疫力，并且认为增强免疫的机制可能与提升小鼠体内肾上腺皮质激素水平，上调细胞因子cAMP、IL-2、IL-6、IFN-γ的表达水平等有关。还有研究显示，铁皮石斛能升高环磷胺模型下免疫低下小鼠的外周白细胞总数，对淋巴细胞产生移动抑制因子有增作用[52]。铁皮石斛还具有促进S180肉瘤小鼠T淋巴细胞转化，增加NK细胞及吞噬细胞活性等功效[53]。此外，覃辉艳[54]等还将铁皮石斛制成复方颗粒剂，发现这种复方颗粒可以促进小鼠的细胞免疫与体液免疫，促进细胞增殖，生成抗体，增强免疫功能。

　　1.1.3.3降血糖活性

　　汤志远等[55]从铁皮石斛中分离得到四种多糖，经过药理实验发现，四种多糖具有降低糖尿病模型小鼠血糖水平的功效。陈丽[56]研究发现，铁皮石斛的降血糖作用在于调节胰岛α，β细胞分泌的激素水平，修复胰岛β细胞的损伤，具有胰内和胰外降血糖的作用；同时还能够增加胰岛素敏感性，调整糖脂代谢。陈爱君[57]等发现铁皮石斛对四氧嘧啶糖尿病小鼠的糖耐量有改善作用。

　　1.1.3.4抗氧化活性

　　衰老经常与自由基与氧化反应相关[58]。唐静月[59]等研究了铁皮石斛花的体外抗氧化活性，通过DPPH自由基清除实验、羟自由基清除实验和ABTS自由基的清除实验三个体外抗氧化体系来从不同方面综合评价了铁皮石斛花体外抗氧化效果。结果表明不同产地铁皮石斛花的80%醇提物三种自由基均有清除作用，且随着剂量增加，清除率呈现上升趋势，说明铁皮石斛花的抗氧化能力较强。邱现创[60]等用不同剂量的铁皮石斛多糖喂养果蝇，计算果蝇的寿命，并对果蝇进行SOD、CAT活性以及MDA的含量，逆重力爬行能力测定。结果表明雄果蝇超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力提高了30%，丙二醛含量降低了46%；雌果蝇CAT活力提高了60%，SOD活力提高了6%，MDA含量降低了20%，果蝇的平均最高寿命提高了20%，结果表明铁皮石斛多糖具有抗氧化，抗衰老的作用。

　　1.1.3.5抗肝损伤

　　Li等[61]研究发现，铁皮石斛可以对四氯化碳诱导的体内肝损伤有一定预防效果。汤小华[62]等研究表明，用铁皮石斛对小鼠进行给药，能同时升高肝中的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶，同时降低血清和肝的MDA，从而可以减轻脂质过氧化对肝脏造成的伤害，对急性酒精性肝损伤模型的小鼠具有一定的保肝用。还有研究表明[63]，铁皮石斛能够增强慢性酒精性肝损伤小鼠的肝功能。临床研究表明，慢性乙肝患者在接受治疗的同时，连续服用铁皮石斛，对病情有帮助[64]。

　　1.1.3.6其他药理作用

　　侯少贞[65]实验发现铁皮石斛对醋酸致小鼠扭体有缓解作用，可以减少扭体次数，具有镇痛作用。同时具有抗炎作用，可降低二甲苯导致的小鼠耳郭肿胀率并抑制肉芽肿生长。吴人照[66,67]等研究显示铁皮石斛与尼莫地平同时使用，可以用药物能够提高卒中易感型自发性高血压大鼠的生存率、对血压有一定时间的调节用，对高血压引起的中风有一定的预防作用。钟惠娟等[68]研究了铁皮石斛多糖对高糖诱导大鼠的血管内皮依赖性舒张功能抑制具有保护作用，认为作用机制可能与对内质网应激的抑制和NF-κB信号通路的抑制有关，说明铁皮石斛有助于治糖尿病引起的血管并发症。有相关研究表明，铁皮石斛具有抗肿瘤作用，何铁光等[69]发现从铁皮石斛原球茎中分离出的多糖组分对小鼠肝癌细胞有抑制作用。铁皮石斛中联苄类和菲类成分也被报道具有抗肿瘤作用[70]。

　　1.2中药抗氧化与免疫调节研究方法概况

　　1.2.1中药抗氧化研究

　　1.2.1.1ABTS法体外测定抗氧化能力

　　Miller等人首次开创并使用了ABTS法，该方法适用于评价天然产物抗氧化活性[71]。ABTS是一种过氧化氢酶的底物，容易发生电子专业生成自由基，可以通过紫外分光光度计进行测定。加入待检测样品，通过对ABTS自由基的清除能力研究，可以了解天然产物抗氧化活性的大小[72]。ABTS法与其他几种体外测定总氧化能力的方法相比，实验的时间快，所需材料的费用低，仪器设备操作简单。ABTS法更加的简便、快速，与抗氧化活性的相关性强[73]，所以较为广泛地应用于生物药品、中草药、果蔬类等物质的抗氧化能力测定。张乃珣等[74]通过ABTS法来研究红松多酚与黑木耳多糖、灵芝孢子多糖联合使用的体外抗氧化活性。

　　1.2.1.2DPPH自由基清除能力测定

　　DPPH自由基又称1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，在517nm处有一强吸收，它的乙醇溶液呈紫色。DPPH的单电子与药物进行配对后，颜色会变淡，紫外吸收也会逐渐消失。袁亚男[75]等通过DPPH法对31种黄酮酚酸类化合物以及槐米、黄芩、木蝴蝶等十种中药样品进行抗氧化活性研究，研究结果显示，黄酮、酚酸类化合物中酚羟基的取代个数和位置会影响样品清除DPPH自由基的能力。余兰彬[76]等通过DPPH法对人参、白芍、甘草、当归、银杏叶五种中药样品进行抗氧化活性研究，陈玉霞等[77]使用DPPH法测定了41种抗衰老中草药的抗氧化活性，认为乙提取浓度显着影响抗氧化能力，50%乙醇提取效果最好。

　　1.2.1.3·OH清除能力的测定

　　外界刺激与人体自身新陈代谢都会产生一些活性氧自由基，其中羟自由基（·OH）的对人体伤害最大。寻找能够清除羟自由基的药物很重要[78,79]。王征帆[80]以芬顿体系产生的·OH，羟基自由基有很强的氧化性，可氧化罗丹明B，通过对测定罗丹明B最大吸收波长处吸光度下降的程度来评价样品清除·OH自由基的能力。赵咏梅等[81]研究了999感冒灵、Vc银翘片、和感冒清胶囊这几种中成药对·OH自由基的清除能力，认为单一中药往往含有多酚、黄酮类化合物、酚酸类和胡萝卜素等成分，中成药的抗氧化活性是多种成分联合作用的结果。

　　1.2.1.4超氧阴离子(O2·-)清除能力的测定

　　人体内在新陈代谢的过程中会产生自由基，某些生理过程需要自由基的协助，但是同时过量的自由基会对人体造成伤害。自由基过多会导致衰老与疾病，而很多抗氧化药物的作用机制在于清除自由基[82]。当邻苯三酚处于碱性条件下时，会自氧反应产生超氧阴离子自由基和一种中间物，中间物与超氧阴离子自由基发生反应，又生成一种带有颜色的中间产物，这个产物在紫外有吸收，吸收度呈现线性趋势，可以通过紫外吸光度来反应抗氧化剂的自由基清除能力[83]。胡天喜等[84利用了黄嘌呤—黄嘌呤氧化酶化学反应生成(O2·-)自由基，再加入化学发光剂Luminol使其产生发光，对药品的的抗氧化作用进行研究。

　　2.2.5还原力测定

　　还原力是对抗氧化物质提供电子能力的评价标准，与其抗氧化活性是相关的。比如自由基清除试验以及抑制脂质过氧化试验等，都需要通过氧化还原反应介导的，还原力高的抗氧化物质可以使一些自由基接受电子变为稳定的分子而失去活性，减少脂质过氧化反应产生的中间氧化物，达到清除自由基的作用。因此，对待测品还原力大小进行测定可以评价天然产物的抗氧化活性[85]。陈欣等[85]对以还原力为依据比较了香菇、杏鲍菇、金针菇及美味牛肝菌多糖的抗氧化活性，结果显示4种食用真菌多糖的还原能力均随着多糖质量浓度的提高而提高，美味牛肝菌多糖的还原能力最强。顾玮蕾等[86]研究了马齿苋、积雪草、旱莲草、枇杷核、女贞子和莱菔子的还原力，在还原力方面,其中积雪草还原力最强。

　　2.2.6总抗氧化能力的测定

　　总抗氧化能力是用于评价药品抗氧化能力的综合综合性指标[87]。阙斐等[88]研究了灵芝、香菇、黄芪、甘草、丹参5种中药的总抗氧化能力，认为其具有抗氧化能力物质能够延缓衰老，并且延缓衰老能力可能与酚类物质有关。张玥等[89]研究了灵芝三萜类化合物的总抗氧化能力与AD大鼠学习记忆能力，认为总抗氧化能力会影响，得出结论，总抗氧化活性与防止AD的机制有关。

　　1.2.2中药免疫调节研究

　　1.2.2.1促进免疫器官生长发育

　　免疫相关的器官发育状态，重量，健康程度，会影响生物体的免疫能力[90]。葛剑等[91]发现马齿苋多糖可极显着提高雏鸡胸腺、脾脏和法氏囊指数，并能显着提高血清指数和总抗氧化水平。李富煌等[92]研究发现了由熟地、川芎、何首乌中药组成的中药复方能促进胸腺、脾脏的发育、生殖。

　　1.2.2.2促进免疫细胞增殖

　　杨仲[93]研究发现，迭鞘石斛可极显着提高小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞的增值(P﹤0.01)，低浓度时没有增强作用。郭建巍等[94]。用MTT法检测当归多PBMC培养液对外周血单个核细胞的增殖作用。王晓东等[95]研究了银杏内脂B对LPS活化的小鼠腹膜巨噬细胞增殖、吞噬及产生NO和ROS的影响。王毛妮等[96]通过MTT法证实三物白散体外可促进巨噬细胞(Ana-1细胞)活化、增殖及吞噬能力。

　　1.3本课题的立题背景及意义

　　石斛为常用中药,其药用历史十分悠久,历代本草均有收载。我国76种石斛中约有40种为药用石斛。2010版与2015版《中国药典》收载了其中金钗石斛，鼓槌石斛，流苏石斛，铁皮石斛4个品种。铁皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraeMigo）为药典中单独一项，主要分布在中国安徽、浙江、福建等地。现代研究表明，铁皮石斛有增强免疫，抗肿瘤，抗氧化，抗疲劳等药理作用。其中霍山所产的铁皮石斛是药用石斛中的上品，为历代医家所推崇。石斛属植物来源众多，目前仅对少数的化学成分进行了研究。主要有菲类及其衍生物、联苄类、萜类、黄酮类、生物碱类、苷类和糖类等。鉴于指纹图谱在药材质量评价及辨别真伪方面的优势，本文对不同产地的铁皮石斛与霍山铁皮石斛进行比较并进行聚类分析，为不同产地铁皮石斛品质研究提供初步依据；通过LC-MS等方法分析霍山产四种石斛的化学成分，为石斛资源的综合利用提供参考。建立了不同石斛总黄酮，多糖，柚皮素等成分的含量测定方法，分析石斛类药材成分含量差异，为不同石斛品质研究提供初步依据。对霍山铁皮石斛不同极性部位进行免疫调节活性筛选，抗氧化活性筛选，为进一步研究霍山铁皮石斛活性成分提供参考，为霍山铁皮石斛产品开发应用提供科学依据。

　　1.4本论文研究的主要内容

　　本课题来源为：安徽省石斛产业化开发协同创新项目（1）不同产地铁皮石斛甲醇提取物指纹图谱研究；（2）霍山产四种石斛甲醇提取物HPLC指纹图谱研究及LC-MS成分分析；（3）石斛类药材中柚皮素、石斛酚、总黄酮、多糖含量分析；（4）霍山铁皮石斛不同极性部位体外抗氧化及促免疫细胞增殖活性研究。

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　　第二章 不同产地铁皮石斛甲醇提取物指纹图谱研究
　　2.1 仪器与试剂
　　2.1.1 仪器
　　2.1.2 试剂
　　2.1.3 实验材料
　　2.2 方法与结果
　　2.2.1 供试品溶液的制备
　　2.2.2 铁皮石斛 HPLC 指纹图谱的研究1
　　2.2.3 不同产地铁皮石斛综合聚类分析
　　2.2.4 不同铁皮石斛样品主成分分析
　　2.3 本章小结

　　第三章 霍山产四种石斛甲醇提取物 HPLC 指纹图谱研究及 LC-MS 成分分析
　　3.1 材料与方法
　　3.1.1 仪器
　　3.1.2 试剂
　　3.1.3 实验材料
　　3.1.4 石斛类药材指纹图谱研究及相似度评价
　　3.1.5 霍山产四种石斛 HPLC 指纹图谱研究
　　3.1.6 霍山产四种石斛 LC-MS 研究
　　3.2 结果与分析
　　3.2.0 霍山铁皮石斛对照指纹图谱的建立
　　3.2.1 石斛类药材指纹图谱的建立
　　3.2.2 霍山四种石斛指纹图谱的建立
　　3.2.3 共有峰的指认和鉴定
　　3.2.4 聚类分析
　　3.2.5 不同石斛样品主成分分析
　　3.3 本章小结

　　第四章 石斛类药材中柚皮素、石斛酚、总黄酮、多糖含量分析
　　4.1 高效液相色谱紫外检测法测定石斛类药材中柚皮素与石斛酚
　　4.1.1 仪器与材料
　　4.1.2 方法
　　4.1.3 结果与讨论
　　4.2 紫外分光光度法测定石斛类药材中总黄酮.
　　4.2.1 仪器与材料
　　4.2.2 方法
　　4.2.3 结果与讨论
　　4.3 紫外分光光度法测定石斛类药材中多糖
　　4.3.1 仪器与材料
　　4.3.2 方法
　　4.3.3 结果与讨论
　　4.4 不同产地铁皮石斛样品柚皮素、石斛酚、总黄酮、多糖含量分析
　　4.5 本章小结

　　第五章 霍山铁皮石斛不同极性部位体外抗氧化及促免疫细胞增殖活性研究
　　5.1 霍山铁皮石斛不同部位体外抗氧化活性研究
　　5.1.1 材料与仪器
　　5.1.2 实验方法.
　　5.1.3 结果与讨论
　　5.2 霍山铁皮石斛不同部位对巨噬细胞 ANA-1 增殖的影响
　　5.2.1 仪器与试剂
　　5.2.2 实验方法
　　5.2.3 结果与讨论
　　5.3 本章小结

第六章全文总结与展望

　　铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo）的干燥茎，是药食两用的名贵药材之一，具有独特的药用价值。铁皮石斛含有多糖、黄酮、生物碱、菲类、联苄类、氨基酸等多种活性成分，现代研究表明，铁皮石斛有抗氧化、抗肿瘤、调节免疫力、缓解疲劳、治疗糖尿病等药理作用。铁皮石斛目前主要分布在中国安徽、浙江、福建等地。其中安徽省霍山县所产的铁皮石斛又名万丈须，生长条件极为苛刻，作为安徽省道地药材一直倍受社会各界的关注，是药用石斛中的上品，为历代医家所推崇。本文从HPLC指纹图谱，相似度评价，聚类分析等方面对霍山铁皮石斛及其他产地铁皮石斛，以及其他品种石斛药材进行了比较，为铁皮石斛品质鉴别，质量控制及资源的综合利用提供参考；同时通过LC-MS等方法分析霍山产四种石斛的化学成分。建立了石斛类药材总黄酮，多糖，柚皮素，石斛酚成分的含量测定方法，分析石斛类药材成分含量。对霍山铁皮石斛不同极性部位进行免疫调节活性筛选，抗氧化活性筛选，阐明霍山铁皮石斛的免疫调节物质基础，为进一步研究提供参考。

　　6.1主要结论

　　1、不同产地铁皮石斛甲醇提取物指纹图谱研究。建立了不同产地铁皮石斛甲醇提取物HPLC指纹图谱，共确定了12个共有峰，霍山铁皮石斛的共有峰总面积较高，对其进行SPSS聚类分析，结果显示铁皮石斛样品可以分为两类，5批霍山铁皮石斛为一类，其他产地铁皮石斛为一类。指纹图谱相似度分析结果显示，与霍山铁皮石斛的对照指纹图谱对比，5批霍山铁皮石斛的相似度极高，在92.6%-94.8%之间，说明霍山铁皮石斛之间没有较大差异；临安、乐清、盐城、云南所的铁皮石斛相似度在17.5%-41.5%之间，表明不同产地的铁皮石斛HPLC指纹图谱存在一定的差异，霍山铁皮石斛与其他铁皮石斛相比，具有一定的特殊性。主成分分析显示铁皮石斛样品可分为两类：五批霍山铁皮石斛为一类，其他产地铁皮石斛为一类。主成分分析结果与聚类分析结果一致。

　　2、霍山产四种石斛甲醇提取物HPLC指纹图谱研究及LC-MS分析。以霍山铁皮石斛样品作为参照，研究了石斛类药材甲醇提取物的HPLC指纹图谱，并对其进行了相似度研究。结果显示霍山产的铜皮石斛、霍山石斛、河南石斛与霍铁皮石斛的相似度较高。霍山产四种石斛共有32个共有峰，通过LC-MS分析，初步鉴定了其中13个化合物，分别是2,4,7-三羟基-9,10-二氢菲、N-p-香豆酰酪胺、反-N-(4-羟基苯乙基)阿魏酸酰胺、3,4′5-三羟基-3′-甲氧基联苄、DendrocandinC、柚皮素、二氢松柏醇二氢对羟基桂皮酸酯、（R）-3,4-二羟基-5,4′,α-三甲氧基联苄尿苷、4′,5-二羟基-3,3′-二甲氧基联苄、3,4′-二羟基-5-甲氧基联苄、3,4-二羟基-5,4′-二甲氧基联苄、Denbinobin。采用SPSS聚类分析法进行分析，结果显示石斛样品可以分为两类，5批霍山铁皮石斛为第一类，其他石斛为第二类，第二类中铜皮石斛、霍山石斛、河南石斛各聚为一类。指纹图谱相似度分析结果显示，与霍山铁皮石斛的对照指纹图谱对比，铜皮石斛，霍山石斛，河南石斛与铁皮石斛的相似度在73.0%-80.7%之间，表明铜皮石斛、霍山石斛、河南石斛与铁皮石斛之间有定的相似性。主成分分析显示安徽霍山产四种石斛样品可分为四类：霍山铁皮斛为一类，铜皮石斛为一类，霍山石斛为一类，河南石斛为一类。主成分分析结果与聚类分析结果一致。

　　3、石斛类药材中柚皮素、石斛酚、总黄酮、多糖含量分析。采用高效液相色谱法法测定了不同产地铁皮石斛，霍山产铜皮石斛、霍山石斛、河南石斛以及金钗石斛、鼓槌石斛、流速石斛和紫皮石斛中柚皮素、石斛酚成分含量的。霍山产铁皮石斛中柚皮素含量高于其他产地铁皮石斛。其中石斛酚仅在5批霍山铁皮石斛以及霍山产铜皮石斛，霍山石斛，河南石斛，鼓槌石斛中检测到，其他产地铁皮石斛中石斛酚含量太低没有检出。采用紫外分光度法测定石斛类药材中总黄酮成分含量。12批铁皮石斛样品中，5批霍山铁皮石斛的总黄酮含量较高，为3.93～4.48mg/g，其他产地铁皮石斛总黄酮含量为0.79～2.13mg/g。采用2015版中国药典铁皮石斛多糖测定方法测定石斛类药材中多糖成分含量。12批铁皮石斛样品中，5批霍山铁皮石斛的多糖含量较低，为150.37～239.41mg/g，其他产地铁皮石斛多糖含量为279.47～403.22mg/g。霍山所产的铁皮石斛在野生条件下生长，所以多糖含量较低，总黄酮，柚皮素，石斛酚等小分子成分含量较高。

　　4、霍山铁皮石斛不同极性部位体外抗氧化及促免疫细胞增殖活性研究。采用DPPH自由基清除能力测定、·OH自由基清除能力测定、还原力性能测定和总抗氧化性能测定法，研究霍山铁皮石斛不同极性部位体外的抗氧化活性。霍山铁皮石斛正丁醇部位和乙酸乙酯部位具有较好的DPPH清除能力，仅次于Vc。其中乙酸乙酯部位>正丁醇部位。霍山铁皮石斛不同极性部位还原能力为：正丁醇部位>乙酸乙酯部位>总水提物>剩余水部位>粗多糖。霍山铁皮石斛不同极性部位总抗氧化能力：正丁醇部位>乙酸乙酯部位>剩余水部位>总水提物>多糖。霍山铁皮石斛正丁醇部位的·OH清除能力比较明显。

　　采用MTT法测定霍山铁皮石斛不同极性部位促进巨噬细胞ANA-1增殖作用，结果显示总水提物在浓度为400μg/mL时，能显着促进巨噬细胞ANA-1的增殖，当浓度过高时，其生长会受到抑制；粗多糖在作用浓度为400μg/mL，600μg/mL时，能显着促进巨噬细胞ANA-1的增殖；霍山铁皮石斛乙酸乙酯部位在作用浓度为25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL时，能显着促进巨噬细胞ANA-1的增殖，当浓度过高时，其生长会受到抑制；正丁醇部位各浓度都能显着促进巨噬细胞的增殖，其中100μg/mL时，促进增殖效果最显着；剩余水部位在作用浓度为100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL时，能显着促进巨噬细胞的增殖，当浓度过高时，其生长会受到抑制。

　　6.2工作展望

　　本论文还有以下几个问题尚待进一步研究：

　　1、霍山铁皮石斛不同部位的LC-MS化学成分分析。

　　2、对霍山铁皮石斛活性部位进行分离，以探讨活性部位的物质基础。

　　3、研究霍山产铁皮石斛、铜皮石斛、霍山石斛、河南石斛之间化学成分的差异，以及对其药理活性进行比较。

　　参考文献

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