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EAE大鼠模型实施益肾活血法的作用研究
时间:2017-06-25
实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)是发生于中枢神经系统的免疫性疾病,普遍认为EAE是研究多发性硬化(MS)理想的模型[1]。因此,本研究建立 EAE 模型,检测益肾活血法对EAE大鼠模型的影响及对神经干细胞增殖分化的机制,对 EAE 及 MS 治疗具有重要意义。
1、材料方法
1.1、材料 80 只健康 Wistar 大鼠,6 ~ 8 周龄,体重 170~210 g;15 只雌性豚鼠,体重 380~450 g,由河南中医药大学试验动物中心提供。完全福氏佐剂、5-溴脱氧-2-尿苷嘧啶均购自 sigma 公司;IL-4、IL-17、INF-γ试剂盒均购自上海晨易生物有限公司;T 淋巴细胞亚群检测试剂盒购自美国 Biosciences 公司;益肾活血方由河南省中医院制剂室提供;总 RNA 提取试剂盒和逆转录试剂盒购自天根生化科技有限公司;ABI7300 实时荧光定量系统购自美国 Applied Biosystens。
1.2、方法 (1)EAE 模型的制备,取出豚鼠脊髓及脑的延髓部,剥离脊膜,置于离心管中称重后按照1 g脑脊髓加入1 ml 生理盐水的比例制成匀浆,匀浆液与完全福氏佐剂按1:1 比例混合研磨;实验第 1 天,Wistar 大鼠腹腔注 射 戊 巴 比 妥 钠 (50 mg / kg) 麻 醉,无 菌 状态下给大鼠按 0.4 ml/只 4 足垫注射匀浆液与完全福氏佐剂混合液。
(2)动物分组及给药,大鼠随机分为正常对照组、EAE 对照组和低、中、高剂量益肾活血法组,每组16 只,正常对照组和 EAE 对照组不做任何处理,低、中、高剂量益肾活血法组连续 2 周分别应用 40、80、160 mg/kg·d益肾活血法灌胃 1 次。(3)根据病理学方法检测大鼠发病时间和高峰期神经功能障碍评分,ELISA 检测IL-17、IL-4、IFL-γ 浓度,流式细胞仪检测 CD4+和 CD8+比例,BrdU 标记法检测神经干细胞增殖,RT-PCR 检测 Hes1 和 Mash1 mRNA 表达。
1.3、统计学方法
数据用 SPSS20.0 软件分析。
2、结 果
2.1、发病时间和高峰期神经功能障碍评分 与 EAE 对照组比较,低、中、高剂量组潜伏期显着增加,进展期和神经功能障碍评分显着降低(P<0.01),低、中、高剂量组潜伏期依次增加,进展期和神经功能障碍评分依次降低(P<0.01),说明益肾活血法能延长大鼠的潜伏期时间,缩短进展期时间,降低高峰期大鼠神经功能障碍评分,其程度与益肾活血法剂量相关。
2.2、IL-17、IL-4、IFL-γ 浓度 EAE 对照组和低、中、高剂量组脑组织匀浆中IFL-γ、IL-17 浓度显着高于正常对照组,IL-4 浓度显着低于正常对照组;低、中、高剂量组IFL-γ、IL-17 浓度显着低于 EAE 对照组,IL-4浓度显着高于 EAE 对照组;低、中、高剂量组 IFL-γ、IL-17 浓度依次下降,IL-4 浓度依次上升( P<0.01) 。
2.3、发病高峰期 CD4 + / CD8 + 与正常对照组比较,EAE 对照组和低、中、高剂量组血中 CD4+ / CD8+显着降低(P<0.01);与 EAE 对照组比较,低、中、高剂量组CD4+ / CD8+显着上升( P<0.01) 。
2.4、益肾活血法对大鼠海马齿状回 BrdU 表达的影响与 EAE 对照组比较,中剂量组 BrdU 阳性细胞平均光密度显着高于低剂量组,高剂量组显着高于中剂量组(P<0.01)。
2.5、益肾 活 血 法对 神经 干细胞 分 化 基 因 Hes1 和Mash1 mRNA 表达影响 与 EAE 对照组比较,低、中、高剂量组均能提高Hes1 和 Mash1 mRNA 表达量,中剂量组显着高于低剂量组,高剂量组显着高于中剂量组(P<0.01),低、中、高剂量组之间差异不显着(P>0.05)。
3、讨 论
本研究结果显示,低、中、高剂量组大鼠脑组织匀浆中IFL-γ、IL-17 浓度降低,IL-4 浓度升高,说明益肾活血法能调节IL-17、IL-4、IFL-γ 降低 EAE 的发生。
本研究结果显示,比较于EAE 对照组,中剂量组BrdU 阳性细胞平均光密度显着高于低剂量组,高剂量组显着高于中剂量组(P<0.01),说明益肾活血法能提高EAE神经干细胞的增殖。
神经干细胞的增殖和分化受其内在基因的调控,Mash1被认为是正性分化调节基因,Hes1 被认为是负性分化调节基因,两者之间可发生拮抗作用[2]。
本研究结果显示,与 EAE 对照组比较,低、中、高剂量组均能提 高Hes1 和 Mash1 mRNA 表 达 量,中 剂 量 组Hes1mRNA 表达量显着高于低剂量组,高剂量组显着高于中剂量组(P<0.01),低、中、高剂量组 Mash1 mR-NA 表达量之间差异不显着( P >0.05),提示益肾活血法通过上调Hes1 表达促进神经干细胞增殖。
综上所述,益肾活血法能延长 EAE 大鼠发病潜伏期,缩短进展期,降低发病高峰期神经功能受损;降低CD4+ / CD8+比例;降低促炎因子 IFL-γ、IL-17 分泌,升高抗炎因子 IL-4 分泌;通过上调 Hes1 增加神经干细胞增殖。
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