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三种结核分枝杆菌ＲNA提取方法的效果比较
时间:2017-06-25
结核杆菌是引起人畜共患传染病结核病的主要病原菌，可通过空气和畜产品等途径传给人或其他动物，尤其是牛结核病不但会给畜牧业带来严重影响，也威胁人类健康[1].由于传统检测结核病诊断方法的局限性，不利于快速准确地诊断肺结核及其疗效，急需开发快速准确的检测方法[2].
近年来，分子诊断技术为结核杆菌检测开辟了一条新路，如环介导恒温扩增检测技术、RNA 恒温扩增技术、基因芯片技术等。但这些技术的应用都是以获得高质量结核杆菌的 DNA 和 RNA 为前提，而结核分枝杆菌的 mRNA 半衰期极短，细胞壁脂质含量又很高且细胞壁裂解困难，这些加大了结核分枝杆菌 RNA 提取的难度[3].本研究分别采用玻璃珠处理法、超声破碎法和甲醇裂解法对结核菌细胞壁处理后进行提取，探讨三种方法对结核分枝杆菌 RNA 提取的效果，以期获得一种简单、高效的结核分枝杆菌 RNA 提取方法。
1 材料与方法。
1. 1 材料与试剂。
结核分枝杆菌 H37Rv 标准株（ 吉林市结核病防治研究所） ; Trizol 试剂（ Invitrogen） ; 直径 0. 5mm 玻璃珠（ 美国 Sigma） .
1. 2 试验方法。
1. 2. 1 结核分枝杆菌菌悬液的制备取 H37Rv 标准株，接种于改良罗氏培养基，37℃培养28 ~42d[4].称取9 份湿重约 30mg 的 H37Rv 标本，分别标记为玻璃珠法、超声波法和甲醇裂解法，每组设三个平行对照。
1. 2. 2 结核分枝杆菌总 RNA 的提取前处理各加入 1 mL Trizol 后涡旋振荡混匀，分别用三种破壁方法进行前处理。玻珠法加玻珠 0. 2 g,静止5 min; 超声波法先 - 80℃ 放置 10 min,沸水速融后240 W超声波处理 3 次，每次 3 min,间歇 15 s; 分别加入 200 μL 氯仿，涡旋振荡1 min,冰置10 min.甲醇裂解法加入 1 mL 新配置的氯仿甲醇溶液（ 氯仿∶ 甲醇 =3∶ 1） ,涡旋振荡 1 min,冰置 10 min[5].
1. 2. 3 结核分枝杆菌总 RNA 的提取4℃ ,12 000 × g 离心 15 min,取上层水相加入等量的异丙醇混匀，-20℃静置 1 h.4℃，10 000 × g 离心10 min 弃上请，70% 乙醇洗 2 次，干燥后加 DEPC 水溶解。
1. 2. 4 结核分枝杆菌总 RNA 鉴定取 5 μL RNA 样品进行 1% 的变性琼脂糖凝胶检测，判断 RNA 的完整性； 并取 1. 5 μLRNA 样品用快速微量紫外测定仪测定 RNA 的浓度和纯度。
2 结果与讨论。
2. 1 结核分枝杆菌 RNA 的浓度和纯度检测由表 1 可知，三种方法均能获得一定浓度的RNA.其中甲醇裂解法提取的 RNA 浓度最高，为115. 05 ng / μL,其 OD260 /280值甲醇裂解法最好，在 1. 9~ 2. 0,OD260 /230在 2. 0 ~2. 3,说明此法提取的样品中，蛋白质、盐类等基本去除干净。其次为玻璃珠法，超声波法提取的 RNA 浓度最低，可能是产生了热量影响了RNA 得率。
2. 2 结核分枝杆菌 RNA 的完整性检测。
采用 1%变性琼脂糖凝胶电泳对提取的结核分枝杆菌 RNA 进行完整性检测，图 1 中三种方法均看到了23SrRNA、16SrRNA 和 5SrRNA 三条带，但超声法中条带发生弥散现象，说明高热量导致 RNA 降解； 而甲醇裂解法条带更明亮清晰，且 23S 近乎 16S 条带浓度的2 倍，说明 RNA 较完整，无降解现象。玻璃珠法虽不如甲醇法好，但也可用于结核杆菌 RNA 的提取。
3 结论。
结核分枝杆菌由于其细胞壁脂质含量高，很难像其他细菌细胞一样用通用的裂解剂将结核分枝杆菌细胞快速裂解。本研究采用三种方法处理结核分枝杆菌细胞壁，并用 Trizol 进行 RNA 提取，结果超声波法由于产生较大热量影响了 RNA 得率和完整性，玻璃珠法虽不如甲醇裂解法好，但避免了甲醇的毒性。甲醇裂解细胞壁法提取的结核分枝杆菌 RNA 的得率明显高于其他两种方法，因为甲醇能迅速溶解脂质，瞬间穿透并破坏结核分枝杆菌的脂质细胞壁，使细胞质中的RNA 释放[3].因此，甲醇裂解法和玻璃珠法均可以用于 RNA 的提取，但甲醇裂解法更好。
参考文献：
[1] Shamim Akhtar,Sampa Sarkar,Abhishek Mishra,Dhiman Sarkar. Amethod to extract intact and pure RNA from mycobacteria[J]. Analyti-cal Biochemistry,2011,（ 417） : 286 - 288.
[2] M. D. Bashyam,A. K. Tyagi. An efficient and high yielding method forisolation of RNA from mycobacteria[J]. Biotechniques,1994,（ 17 ） :834 - 836.
[3] 贾红彦，李自慧，杜博平，等。 结核分枝杆菌总 RNA 提取方法的比较研究[J]. 临床肺科杂志，2012,17（ 7） : 1246 -1248.
[4] 罗影殊，高文凤，黄偌颖，等。 不同破壁方法提取结核分枝杆菌总RNA 的比较[J]. 中国防痨杂志，2013,35（ 3） : 183 - 186.
[5] 俞垭美，王姗姗，褚丽花，等。 适用于结核分枝杆菌 RNA 抽提的实验方法学研究[J]. 临床肺科杂志，2016,21（ 4） : 609 -612.
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