葡萄膜炎动物模型最新研究成果

时间:2017-06-25

葡萄膜炎（ uveitis） 是一类常见的致盲眼病，多发于青壮年，其临床类型多，发病机制复杂，治疗棘手。人类葡萄膜炎除少数由感染引起，多数发病与自身免疫反应有关。成功建立葡萄膜炎动物模型开阔了对葡萄膜炎的免疫学、分子生物学及细胞生物学等学科的研究途径，为探索人类葡萄膜炎的发病机理、寻找防治靶点、研发新型治疗药物奠定了必备的实验条件。因此，如何建立稳定性好、特异性高和可重复性强的动物模型，在人类葡萄膜炎研究中有重要意义。

　　一、EAU 模型诱导抗原。

　　研究发现，能够引起葡萄膜炎的眼内组织抗原有十余种，主要包括视网膜抗原和非视网膜抗原，利用这些抗原能诱发动物葡萄膜炎反应，建立 EAU 模型。但不同抗原的致炎活性及炎症发生部位、程度、临床症状均不同[1].

　　1.视网膜抗原： 多种视网膜抗原可诱发以视网膜炎为主要组织病理学改变的 EAU 动物模型，主要包括视网膜可溶性抗原、感光细胞间维生素 A 类结合蛋白、视紫红质和恢复蛋白等。1977 年 Wacker 等[2]首次利用提纯的牛视网膜可溶性抗原（ soluble antigen,S-Ag） ,成功诱导出实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎（ Experimental autoimmune uveitis,EAU） 模型，为研究葡萄膜炎提供了新的开端。S-Ag 是一种细胞内光感受器蛋白，主要存在于动物及人的感光细胞和松果体内，研究表明[3]动物及人的 S-Ag 的抗原性基本相同，因此，S-Ag 是诱导模拟人类葡萄膜炎动物模型的常用抗原。免疫动物 1~ 4天后，炎症反应达到高峰，病理学特点为全葡萄膜和视网膜炎症； 光感 受 器 间 维 生 素 A 类 结 合 蛋 白 （ interphotoreceptorretinoid binding protein,IRBP） 是诱导 EAU 模型的常用抗原，存在于光感受器间基质中，经 IRBP 免疫后，实验动物第 13 天症状明显，虹膜、睫状体、脉络膜、视网膜均可见细胞凋亡，以虹膜睫状体最明显[4]
; 视紫红质（ rhodopsin） 是一种膜固有蛋白，存在于视网膜中，可联合弗氏完全佐剂诱导敏感动物建立 EAU 模型，但致炎活性低于 S-Ag 和 IRBP.恢复蛋白是一种钙结合蛋白，存在于视网膜和松果体内，研究表明恢复蛋白是视网膜癌的靶分子。Gery 研究团队发现，恢复蛋白能在 Lewis 大鼠诱发严重的葡萄膜炎和松果体炎，其炎症表现与 S-Ag 诱发的 EAU 相似[5].

　　2.非视网膜抗原： 引起 EAU 的非视网膜抗原主要包括黑色素相关抗原、髓磷脂碱性蛋白、晶状体蛋白、S100.黑色素相关抗原由 Broekfyse 等学者首次从牛的视网膜色素上皮及脉络膜中提取并纯化，与弗氏完全佐剂混合后免疫 Lewis 大鼠，成功诱导出实验性自身免疫性前葡萄膜炎（ EAAU） 动物模型，发病迅速，主要为眼前段炎症，多为双眼发病。病理表现与人类急性前葡萄膜炎相似[6],是研究人类前葡萄膜炎的理想 动 物 模 型。髓 磷 脂 碱 性 蛋 白 （ myelin-basic protein,MBP） ,可诱发 T 细胞介导的 EAU,并伴发实验性变态反应性脑脊髓炎； 晶状体过敏性眼内炎和晶状体诱导性葡萄膜炎，均可能是晶状体蛋白引起的自身免疫反应，动物实验表明，刺破晶状体囊膜可诱发葡萄膜炎。Marak 等利用同种异体或同基因晶状体蛋白抗原免疫大鼠，成功建立了晶状体诱导性肉芽肿性眼内炎动物模型。人类晶状体相关的葡萄膜炎，多发生于眼球穿透伤或白内障术后，主要原因可能为大量晶状体蛋白抗原暴露，引起自身免疫反应导致了葡萄膜炎。

　　3.其他抗原： 近年来，研究者深入分析了能够引起葡萄膜炎的抗原表位及氨基酸序列，并通过分子生物学和蛋白质组学技术，人工合成了肽段以替代提纯的视网膜蛋白。目前，人工合成的肽段已成为葡萄膜炎动物模型理想的造模抗原。在不同品系实验动物中抗原的诱导性有所差异，现已证明 R14、R16 等肽段序列能够诱导 Lewis 大鼠建立葡萄膜炎模型[7-8].

　　二、EAU 模型实验动物。

　　实验动物的选择对动物模型的成功建立也非常重要。自从 S-Ag 被分离提纯以来，许多研究者用 S-Ag 免疫大鼠、小鼠、豚鼠、兔及猴等动物，成功地诱发了 EAU 动物模型。由于鼠眼的构造（ 如小梁、Schlemm 管、睫状体、视网膜血管等） 在很多方面和人眼类似，和其他动物相比容易用转基因技术改造和繁殖，且花费少[9],因此研究多选用鼠为模型。

　　诱发葡萄膜炎与实验动物的基因背景、遗传特征、免疫反应状态、视网膜血管供应方式、抗原剂量密切相关。不同品系大鼠对不同抗原敏感性差别较大，其中 Lewis、Buffalo、F344 和ACI 纯系大鼠对 IRBP 和 S-Ag 均易感； BN（ Brown Norway） 大鼠对 IRBP 易感，对 S-Ag 不易感； 而 WF、Rcs rdy+大鼠对 S-Ag易感，对 IRBP 不易感； Lewis 大鼠对 S-Ag、IRBP 抗原及多肽片段均高度易感，是建立 EAU 模型最常用的动物品系； 豚鼠对 S-Ag 易感，而 IRBP 诱导效果不佳[10]; 小鼠较易由 IRBP 诱导出典型的炎症病理过程，而 S-Ag 诱导效果较差。Caspi等[11]发现应用 S-Ag 或 IRBP 诱导小鼠建立 EAU 时，易感性是由小鼠 H-2 决定的。

　　各种转基因或免疫相关基因敲除小鼠模型已成为研究葡萄膜炎机制的重要工具。人类葡萄膜炎与 HLAⅠ类和Ⅱ类中的某些等位基因片段密切相关，其中 HLA-B27 与人前葡萄膜炎相关性较强。HLA-B2704 转基因小鼠自发性葡萄膜炎以前房为主，与人类前葡萄膜炎特点相符，病理发现角膜慢性炎症，房水中有淋巴细胞渗出，口服糖皮质激素可缓解眼部症状[12].HLA-A29 转基因小鼠模型可产生自发性葡萄膜炎病程，而 HLA-DR3 转基因小鼠可在 S-Ag 致敏下成功诱导出葡萄膜炎[13].这类转基因模型从发病机制、病理表现与人类葡萄膜炎高度相似，适用于葡萄膜炎的研究。

　　三、EAU 模型病程及病理组织学表现。

　　1.单向自限性： 利用 Lewis 大鼠诱导的典型 EAU 模型，炎症呈急性-单向自限性[14],眼部炎症出现的时间与抗原类型、剂量相关。通常 S-Ag 或相关肽段诱发的动物模型炎症起病较晚，但程度剧烈。用 S35 肽段免疫 Lewis 大鼠，在抗原注射后 12~14 d 起病，而等剂量 R16 肽段免疫后，大鼠在 10~12 d发病，当百日咳作为佐剂与抗原混合注射后，起病时间可提前约 2 d,而且抗原剂量可以适当减少。通过过继性转移细胞诱导的动物模型，通常于造模后 4~7 d 起病。单向自限性眼内炎症主要特征为血管炎，纤维素性渗出，视网膜结构紊乱，巨噬细胞弥漫性浸润脉络膜、视网膜及视网膜下各层，光感受器细胞层和双极细胞层弯曲、折叠、破损[15].在急性葡萄膜炎中，视网膜内浸润的细胞主要包括中性粒细胞和巨噬细胞。

　　在慢性葡萄膜炎中，视网膜内浸润的细胞主要包括淋巴细胞和巨噬细胞。

　　2.复发性： 在病程上，复发性炎症具有发病急、到达炎症高峰期历时短，炎症消退快、异质性等特点，有些鼠长期保持慢性温和炎症状态。复发性炎症主要特征为视网膜结构紊乱、光感受器细胞层和双极细胞层弯曲、脉络膜增厚以及肉芽肿性炎[14].

　　四、葡萄膜炎发病机制。

　　1.基础免疫学： 葡萄膜炎发病机制复杂，与细菌、病毒、真菌和寄生虫等病原体感染有关，自身免疫性疾病、外伤、肿瘤等也可引起葡萄膜炎。EAU 模型中葡萄膜炎的发病机制与机体产生了针对自身抗原特异性的 T 淋巴细胞（ 主要包括Th1 细胞和 Th17 细胞） 密切相关，同时，调节性 T 细胞在炎症过程中抑制自身免疫应答过程，Th1、Th17 及 Treg 细胞的平衡决定了自身免疫性葡萄膜炎的发生、发展及转归。杨培增教授研究表明[16]

　　IL-23 / IL-17 通路在葡萄膜炎的发生和发展过程中具有重要作用； 同时，发现了 IL-7、IL-27、miR-155 等多种生物分子对 IL-23/IL-17 通路具有促进或抑制作用； 证实了Toll 样受体通路和 Notch 信号通路对 IL-23 / IL-17 通路具有促进作用[17-18]; 同时还发现导致葡萄膜炎发生和复发的重要因素是 Treg 细胞和相关细胞因子的数量减少或功能丧失。目前，对于眼内微环境的稳定机制、调控因素以及自发性、复发性自身免疫性葡萄膜炎模型起病机制的研究是葡萄膜炎基础研究领域的难点。

　　2.临床免疫学： 葡萄膜炎患者血清中 IL-2 水平活动期较稳定期升高，IL-4 水平稳定期较活动期升高，可推测 IL-2 与急性病程有关，IL-4 与葡萄膜炎的恢复有关。李旌团队通过优化人房水样本的采集和定量检测手段，采集、分析了数百例不同类型葡萄膜炎患者的房水样本，发现临床症状相似的前葡萄膜炎患者房水中炎症反应因子的图谱却存在差异，房水中生物化学因子的变化也可反映眼底疾病的变化[19].

　　小结 EAU 模型是研究人葡萄膜炎发病机制及治疗方案的重要工具。但动物模型与人类葡萄膜炎表现存在差异。

　　动物模型的眼内炎症是由外界因素诱发引起的，正常情况下，机体自身存在调控和修复能力，在动物模型 EAU 和 EIU 中均表现为急性自限性炎症病程，且再次诱导出复发性炎症难度很大。而人类葡萄膜炎是发生于免疫功能紊乱、缺乏有效自我调控和修复能力的个体上，多表现为慢性复发性炎症病程。

　　多年来，专家学者致力于研究单向型 EAU 疾病自限性缓解的机制，并且希望通过对单向型 EAU 疾病恢复过程的研究，为复发型 EAU 或者人类葡萄膜炎提供最佳的诊疗方案。

　　参考文献：
　　[1] Adamus G,Chan CC.Experimental autoimmune uveitides: multipleantigens,diverse diseases[J]. Int Rev Immunol,2002,21 （ 2-3） :209-229.
　　[2] Wacker WB,Donoso LA,Kalsow CM,et al. Experimental allergicuveitis: isolation,characterization and localication of a solubleuveitopathogenic antigen from bovine retina[J].J Immunol,1977,119（ 6） : 1949-1958.
　　[3] 余奇，许迅。实验性自身免疫性葡萄膜炎模型的研究进展[J].上海交通大学学报（ 医学版） ,2013,10（ 33） ,1411-1414.
　　[4] 杨培增，Nicole HH,周红颜，等。实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎中浸润细胞的表型及其凋亡的研究[J].中华眼底病杂志，2000,16（ 1） : 35-38.

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