动物模型心脏结构和功能的综合评价技术

时间:2017-06-25

适量运动会对心脏的结构和功能产生影响，在基础实验研究中对心脏结构和功能做出准确的评价就显得尤为重要。目前，在评价心脏结构和功能的方法主要有心脏核磁共振[1]、心电图、组织切片、心室造影和核素心血池显影等。心脏核磁共振、心室造影以及核素心血池显影操作复杂且价格昂贵，在临床上应用较多但在基础实验研究当中应用较少，而超声心动图、组织切片和心脏解剖具有准确性高、价格适中、操作简便等特点。超声心动图具有无创性、可重复性、操作性强、准确性高等特点，特别是能够进行连续观测，避免直接对实验动物进行取材，对于评价实验动物心肌结构和功能的变化具有重要意义，特别是在评价心肌肥大方面，但对操作者水平要求较高； 常规解剖评价心脏结构变化的指标主要由左心室重量/体重（Anat LVM/BW） 和左心室重量 / 胫骨长度（Anat LVM / TB） 来评定，但常规解剖误差率高且不可重复，不能对实验动物进行连续的观测； 组织切片在实验研究中可间接测量心肌细胞的直径和面积，从而在微观上反应心脏结构的变化，但组织切片只能观察局部的组织变化，无法在整体上做出评估。因此建议在建立实验动物模型时运用三种指标来综合评估心脏结构和功能的变化。

　　1 材料和方法。

　　1. 1 运动模型的建立。

　　选取 C57 雄性小鼠，体重（23. 86 ±3. 35） g,SPF 级SD 雄性大鼠，体重（207. 4 ± 7. 51） g,按随机对照原则将实验动物分为四组。小鼠进行 4 周游泳训练，每天训练两次，中间间隔 4 个小时，每周训练六天，采用递增负荷训练，起始强度为 10min/d,每天遵循 10min/d的强度增加，训练时间至 90min/d,直至 4 周结束，严格控制水温在（28 ± 2） °C,保持水的流动性[2-5]; 大鼠进行 8 周跑台训练，每天训练一次，每周训练五天，初速度为 10m/min,坡度为 5°，时间为 30min,逐步递增到 27m/min,坡度为 10°，时间为 60min,坚持训练至 8周[6-10].每笼饲养 4 ~5 只，室温 20 ~ 25°C,相对湿度50% ~ 70% ,每天光照 12h,自由进食和饮水。

　　1. 2 超声心动图及左室结构。

　　对实验动物进行超声心动图检测，采用 Vevo770ultrasound system（Visual Sonics Inc,Toronto,ON Cana-da） 小动物超声仪（探头频率大鼠为 17. 5MHz,小鼠为30MHz） .按 10% 的水合氯醛 300mg /100g 麻醉，脱净胸毛用温水冲洗干净，至显露皮肤，仰卧位固定在恒温加热板上，四肢与心电图电极相连，数据采集时保持实验动物心率在 300 ~400bpm 之间，尽量减少数值的误差，各参数连续测量 3 个心动周期，计算均值。

　　二维及 M 超超声心动图： 探头置于鼠的胸骨前，二维超声显示左室短轴切面，于乳头肌水平，应用 M型超声记录左心室运动曲线，测量指标包括左室舒张末期内径（LVID d） 和收缩末期内径（LVID s） ,左室舒张末期前壁厚度（LVAW d） 和收缩末期前壁厚度（LVAW s） ,左室舒张末期后壁厚度（LVPW d） 和收缩末期后壁厚度和（LVPW s） ,左室射血分数（EF%） ,左室短轴缩短率（FS%） ,计算左心室重量 Echo LVM =1. 05 × [（LVID d + LVPW d + IVS d） d3- LVID d3×0. 8 和左室短轴缩短率 FS% = （LVID d-LVID s） / LVIDd × 100%[11].

　　1. 3 解剖称重。

　　称量空腹体重，超声心动图检测后，12 小时内解剖实验动物，打开胸腔，用冰磷酸盐缓冲液（PBS） 灌洗心脏，排空心室腔中积血，剪除心脏上的血管和脂肪组织 等，称 量 全 心 重 量 （HW） 和 左 心 室 重 量 （AnatLVM） ,测量胫骨长度（TB） .计算全心重 / 体重（HW /BW） 、左心室重 / 体重（Anat LVM / BW） 和左心室重 / 胫骨长度（Anat LVM/TB） .

　　1. 4 组织切片。

　　环形剪取心尖以外部分的组织，置于 4% 多聚甲醛固定 24h,石蜡包埋，每个石蜡块切片 1 张，厚度为5um.采用 olympus 图像分析系统采集图像，用 ImagePro Plus 6. 0 （Media Cybernetics,Carlsbad,CA） 观察每个高倍视野下细胞组织是否整齐排列。采用双盲实验减少主观误差，每组动物随机选取 4 个切片，每个切片视野中随机选取 10 ~12 个完整心肌细胞（包含完整细胞核） ,测定心肌细胞的直径和面积。

　　1. 5 统计学处理实验结果以均数 ± 标准差（X ± SD） 表示。均数比较采用 SPSS 20. 0 进行单因素方差分析 （One-wayANOVA） ,组间比较用独立样本 t 检验，两组数据之间的相关性比较采用 Pearson 相关性分析，图形生成使用prism 5. 0,P < 0. 05表示为显著性差异，P < 0. 01表示极显著性差异。

　　2 结果。

　　2. 1 超声心动图检测结果。

　　小鼠在经过 4 周游泳训练后 EF%、FS% 均明显大于安静对照组（P <0. 05） 差异显著，而 LVID d、LVAWd、LVPW d 以及 LVAW d / LVID d 在两组间无明显差异； 由超声心动图估算的 Echo LVM/BW 与运动组无显著性差异（P <0. 05） 。

　　大鼠在经过 8 周跑台训练后 LVID d、LVPW d、LVAW d / LVID d 均明显大于安静对照组（P < 0. 05） 差异显著，而 LVAW d、EF%、FS% 在运动组和安静对照组间无明显差异； 由超声心动图估算的 Echo LVM/BW与运动组有显著性差异（P <0. 05） .

　　2. 2 解剖称重。

　　小鼠在经过 4 周游泳训练后 BW、Anat LVM、AnatLVM / BW、Anat LVM / TB 在运动组和安静对照组之间没有显著性差异，见表 2.小鼠解剖的左心室重量Anat LVM 和超声心动图估算的左心室重量 Echo LVM高度相关 r =0. 86,P <0. 05.

　　大鼠在经过 8 周跑台训练后 BW、Anat LVM、AnatLVM / BW 在运动组和安静对照组之间有显著性差异（P <0. 05） ,而 Anat LVM/TB 在两组之间有极显著性差异（P <0. 01） ,见表 2.大鼠解剖的左心室重量 AnatLVM 和超声心动图估算的左心室重量 Echo LVM 高度相关 r =0. 968,P <0. 01,见图 1.

　　大鼠和小鼠胫骨长在性成熟之后不会因为外界运动的刺激而产生太大的变化，因此胫骨长度是一个相对稳定的指标[12].

　　2. 3 心肌细胞直径和面积测量。

　　心肌组织固定染色后在高倍显微镜拍照存片，用Image Pro Plus 6. 0 观察测量，计算细胞直径和面积。

　　小鼠经过 4 周游泳训练后细胞直径在运动组与安静组之间无显著性差异，大鼠经过 8 周跑台训练后细胞直径在运动组与安静组之间有极显著性差异P <0. 001;小鼠经过 4 周游泳训练后细胞面积在运动组与安静组之间有极显著性差异P <0. 01; 大鼠经过 8 周跑台训练后细胞面积在运动组与安静组之间有极显著性差异P < 0. 001。

　　3 讨论。

　　在基础实验研究当中，快速准确地确认建模是否成功，是确保实验能够顺利进行和数据可靠的重要基础，在建立心肌肥大模型当中，能够用恰当的方法快速的判定模型的成功与否至关重要。小鼠在经过 4 周的游泳训练后，用超声心动图、解剖称重和组织切片三种方法都显示小鼠的心脏结构在经过训练后没有明显的变化； 大鼠经过 8 周的跑台训练，用超声心动图、解剖称重和组织切片三种方法都显示心脏的结构发生明显的变化，运动组和安静对照组之间存在显著性差异。

　　三种评价手段显示小鼠运动模型没有导致心脏结构的变化，而大鼠运动模型恰好符合预期的实验目标。

　　小鼠的 Anat LVM 和 Echo LVM 高度相关 r =0. 86,P < 0. 01; 大鼠的 Anat LVM 和 Echo LVM 也高度相关 r =0. 968,P <0. 01,说明利用超声心动估算的左心室重量可以准确的评估出心脏结构的变化。高频小动物超声仪可以清晰准确的显示实验动物的左心室结构，并能够获得满意的 M 超左心室收缩舒张运动曲线以及左室后壁心肌组织多普勒频谱，且小鼠的 M 超运动曲线要清晰于大鼠的运动曲线。超声心动图因其无创、准确且可重复性强的特点，很早就应用于临床患者心功能的检测，近年来也逐渐渗透到心功能结构和评价当中。与超声心动图相近的技术是心脏核磁共振（CMR） ,它在用于评定运动性心脏具有无创伤、无辐射、可重复性以及空间分辨率高等特点，在临床上应用广泛[13],心脏核磁共振可以显示心肌组织学特征和心功能，能从整体上清晰直观的观察到心脏的几何形状、心室腔内径和增长率并估算出心室重量、心室腔容积、射血分数（EF%） 等用于评定左心室收缩功能[14],但由于价格昂贵且受到仪器设备的局限性，在实验动物研究当中还是无法广泛的应用，而超声心动图可以很好的替代它用于评定心脏结构和功能的变化。

　　在超声心动图的检测过程中，麻醉剂的使用会影响到动物心脏的舒张功能，这主要是由于不同的麻醉方法和剂量等因素，会直接影响动物的心率继而会影响心脏的舒张功能。目前国内外尚没有在清醒状态下研究动物舒张功能的报道，即使能够在清醒状态下配合进行超声心动检测的小鼠也会因为心率过快而无法清晰的分出舒张早期和晚期的心室运动图谱，只能看到心脏舒张期组织运动的融合波[15],所以在检测过程中实验动物的心率控制在 300 ~400bpm 之间，心动过缓影响心室收缩功能，过快影响检测的准确性，按照标准来注射麻醉剂最大限度的减少麻醉对心脏功能的影响，实验操作中可采用部分气麻。超声心动图检测结果依赖于操作者的技术及声窗的图像质量。

　　目前国内外一般采用心重体重比（HW/BW） 、左心重比体重（Anat LVM/BW） 和左心重与胫骨长（AnatLVM / TB） 之间的比值来界定运动性心肌结构变化。

　　解剖称重在整体上反映出实验动物心脏结构的变化，但缺乏一定的准确性，在实验操作过程中严格控制手术操作，尽量减少不必要的误差。解剖具有不可重复性，无法进行连续性的周期观测，只能通过扩大基数来进行周期性的指标测定，无法达到同批动物连续性观察，这无疑增加了实验的误差和周期。实验动物在运动过程中经常会受到外界刺激发生一些不可控的因素从而导致体重的改变，因此在评价心脏结构和功能上涉及到体重的指标误差较大，而动物的胫骨长在性成熟之后不会因为外界运动的刺激而产生太大的变化。

　　胫骨长在评定运动心脏结构变化中是一个相对稳定的指标，经常会在实验研究当中得到运用。

　　运动训练导致心脏结构功能变化主要是长期血流动力超负荷应激的一种生理代偿现象，这种结构变化与肌小节的增加以及心肌细胞的增大有关[16].这样组织切片就显得尤为重要，HE 染色观察细胞直径和面积，从微观分子水平对心脏的结构做出客观的评价，在实验操作中通过增大样本量，减少组间误差[17].用Image Pro Plus 6. 0 测定细胞直径和面积时采用双盲测验，最大限度减少主观误差。

　　4 结论。

　　在评定运动性心脏结构和功能上采用超声心动图、解剖称重和组织切片三种方法在结果上呈现出一致性，三种手段各有优缺点。其中超声心动图可准确、无创的评价运动性心脏的结构和功能，可进行连续的周期性观测，常规解剖可以在宏观上反应运动性心脏的结构变化，但受客观因素影响较多误差较大，组织切片观察细胞直径和面积则从分子生物学微观角度去观察心脏的结构变化，且清晰直观。在实验研究当中根据实际情况运用三种评价手段从宏观和微观上对心脏的结构和功能做出整体评价。

　　参考文献：
　　[1] 万青，刘铭雅。 心脏核磁共振在心力衰竭中的应用价值[J]. 国际心血管病杂志，2015,42（2） :87-90.

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