温阳益气活血方促血管生成作用机制

时间:2017-06-25

冠心病（Coronary heart disease,CHD）是由冠状动脉粥样硬化导致冠脉管腔狭窄和冠脉痉挛性改变，引起冠状动脉供血相对不足，致使心肌缺血、缺氧所引起的心脏疾病。研究证据表明，中药可从降低心肌耗氧、清除氧自由基、抑制钙超载、抑制细胞凋亡、促血管生成等不同途径起到抗心肌缺血的作用。新血管形成过程中，有多种血管生长调节因子参与，成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）和血管内皮生长因子（VEGF）作为最强有力的两种血管生成因子。

　　FGF-2通过刺激内皮细胞分泌几种蛋白酶和蛋白酶原活化因子，从而导致血管基底膜降解使细胞得以侵入周围基质迁移、增殖，最终分化而形成一个新的、含有一个空腔的血管[1、2].VEGF能特异性地促血管内皮细胞分裂增殖，促血管生成，同时增加血管的通透性，使血管内的成分渗漏，为血管内皮的迁移及血管形成提供基质。温阳益气活血方为治疗CHD的效方，经多年临床应用疗效显著，但其对心肌血管新生作用尚不清楚。该研究通过观察温阳益气活血方对大 鼠 缺血心 肌FGF-2和VEGF分子的影响，探讨中医药的温阳益气活血方促血管生成作用的机制。现将实验方法及结果报告如下。

　　材料与方法。

　　1实验动物清洁级健康SD大鼠40只，雌雄各半，平均体质量（220±20）g.由甘肃中医学院动物实验中心提供。

　　2药物温阳益气活血方组成：制附子10g,桂枝10g,黄芪20g,人参16g,熟地13g,当归10g,白芍16g,赤芍16g,川芎10g,桃仁10g,红花10g,本实验药材由青海省中医院中药房提供颗粒剂（由广东一方制药有限公司生产），用蒸馏水稀释成0.87g/L的溶液。

　　3仪器与试剂多导生理检测仪（荷兰TMSI,型号Mobite）、DJ-500型电子天平（常熟市衡器厂），分析天平，Rotor-gene3000型荧光定量PCR仪（美国Thermo），LG5-2A型低速离心机（北京医用离心机厂），恒温箱，冰箱等。总RNA提取与逆转录试剂盒（16092511）购自大连宝生物有限公司。

　　4方法。

　　4.1分组和喂养40只SD大鼠运用随机数字表随机分组，设正常对照组、假手术组、模型组、中药组，每组10只，分笼饲养于代谢笼内，每笼5只，每组2笼，自由取食。

　　4.2冠心病大鼠模型的建立参照郭乐等[5]的方法造模：SD大鼠经10%水合氯醛250mg/kg腹腔注射麻醉。无菌条件下气管切开，插管、上动物呼吸机正压辅助呼吸。胸部去毛，消毒，沿左锁骨中线纵行切开皮肤2cm,在第四或五肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，快速挤出心脏，在左冠状动脉前降支中上1/3处行结扎后把心脏放回胸腔。逐层关胸，待动物苏醒后拔除气管插管。

　　24h后以心电图ST段下移和T波改变为标准判断其为CHD大鼠模型。术后每只大鼠每天肌注青霉素10万U预防感染。

　　4.3给药与取材方法造模1周后开始灌胃给药，中药组给予温阳益气活血方颗粒2mL·d-1,正常对照组、假手术组和模型组给予同体积的生理盐水灌胃，每天1次，共给药4周。给药结束时禁食不禁水12h,用多导生理检测仪测定心功能和冠脉血流量，脱臼处死大鼠，取出心脏，减去心房及右心室，留取左心室于-80℃保存。

　　4.4心功能测定经房室瓣插入球囊，接压力换能器并输人计算机，记录左心室收缩压（LVSP）、左室内压最大变化速率（±dp/dtmax），并测冠脉血流量（CF）。

　　4.5 RT-FQ-PCR检测FGF-2及VEGF mR-NA的 表 达引 物 参 照Gene Bank序 列，应 用Primer Express5.0软件合成，由大连宝生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应采用Rotor-Gene3000型实时荧光定量PCR仪，用荧光染料SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行PCR扩增。

　　采用30μL反应体系，包括2μL cDNA溶液，特异性上下游引物各0.5μL（20μmol），SYBR Premix ExTaqTM（2×）10μL,ddH2O（灭菌蒸馏水）17μL.

　　采用三步法PCR扩增标准程序：预变性94℃5min,PCR反应94℃20s、53℃30s、72℃30s、共40个循环，历时97min.

　　Ct值反映了模板扩增到一定量拷贝数时（处于指数上升期）所需反应循环数大小，Ct值越大，起始模板量就越小，反之则越大。阴性对照为ddH2O.荧光定量PCR结果参照2-ΔCt数据分析法进行相对定量计算[6、7].

　　2-ΔCt代表食管组织样本中目的基因与β-actin的mRNA表达水平的比值，而ΔCt= Ct specific gene-Ctβ-actin,因此ΔCt值越低表示目的基因在组织中表达水平越高。

　　5统计学方法。

　　计量数据以（-x±s）表示，应用SPSS10.0统计软件，多组间比较采用one-Way方差分析，两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　结果。

　　1各组大鼠心功能变化与对照组和假手术组比较，模型组LVSP、+dp/dtmax及-dp/dtmax的绝对值及冠脉血流量明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，中药组LVSP、+dp/dtmax及-dp/dtmax的绝对值及冠脉血流量明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05）。

　　2各组大鼠心脏FGF-2和VEGF mRNA的表达模型组FGF-2和VEGF mRNA表达水平较正常组和假手术组明显升高 （P<0.05），中药组FGF-2和VEGF mRNA表达水平均较模型组明显升高（P<0.05）；假手术组和空白组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。

　　讨论。

　　冠心病是由冠状动脉粥样硬化导致冠脉管腔狭窄和冠脉痉挛性改变，引起冠状动脉供血相对不足，致使心肌缺血、缺氧所引起的心脏疾病。冠心病心绞痛属中医"胸痹"、"心痛"范畴。其根本病机就是"本虚标实",本虚为气血阴阳不足，不营则痛；标实为痰浊、寒凝、瘀血、气滞等病邪痹阻心脉，不通则痛。虚以气虚为基础，实则以血瘀、痰浊多见。"气为血帅",气虚则无力推动血液运行，血行迟缓而留滞为瘀，气虚血瘀是冠心病发病的重要病机。邓铁涛[8]

　　认为，冠心病病机特点是"正虚为本，邪实为标".故在治疗上要标本兼顾，通补兼施。据此，本课题组在前期临床研究中采用温阳益气活血方治疗CHD,经多年临床应用疗效显著。研究证据表明，中药可从降低心肌耗氧、清除氧自由基、抑制钙超载、抑制细胞凋亡、促血管生成等不同途径起到抗心肌缺血的作用。因此，本课题假设该药通过促进冠心病患者新生血管的形成是其实现临床疗效的作用机制之一。

　　本研究结果显示，与对照组和假手术组比较，模型组LVSP、+dp/dtmax及-dp/dtmax的绝对值明显下降，冠脉血流量明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，中药组LVSP、+dp/dtmax及-dp/dtmax的绝对值表现为升高，冠脉血流量也表现为升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果表明，温阳益气活血方具有改善冠心病大鼠模 型 的 心 功 能 和 血 供。模 型 组FGF-2和VEGF mRNA表达水平较正常组和假手术组明显升高（P<0.05），中药组FGF-2和VEGF mRNA表达水平均较模型组明显升高（P< 0.05）；假手术组和空白组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。

　　结果表明，该药具有上调FGF-2和VEGF基因表达的作用。

　　新血管形成过程中，有多种血管生长调节因子参与，FGF-2和VEGF作为最强有力的两种血管生成因子。

　　FGF-2通过刺激内皮细胞分泌几种蛋白酶和蛋白酶原活化因子，从而导致血管基底膜降解使细胞得以侵入周围基质迁移、增殖，最终分化而形成一个新的、含有一个空腔的血管[1、2].VEGF能特异性地促血管内皮细胞分裂增殖，促血管生成，同时增加血管的通透性，使血管内的成分渗漏，为血管内皮的迁移及血管形成提供基质[3、4].研究表明，FGF-2可通过Ras/Raf/MEK/ERK途径促进血管增生的[9].由此可推断，温阳益气活血方具有促进心肌新生血管形成的作用，该药通过调节心肌FGF-2和VEGF基因表达促进心肌新生血管的形成是其作用机制之一。

　　综上所述，温阳益气活血方具有通过上调FGF-2和VEGF基因表达促进心肌新生血管的形成，改善心肌供血和提高心功能的作用。

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