菌克软膏的体外抗菌活性研究

时间:2019-10-13

　　0 引言

　　菌克软膏为我院自制制剂，批准文号： 南制字（ 2011） F16001,其主药为盐酸林可霉素、硝酸咪康唑及醋酸地塞米松，临床适用于手、足、体、股、头癣及湿疹、脂溢性皮炎、过敏性皮炎、皮肤瘙痒等皮肤疾病[1-3].该复方制剂目前尚无体外抗菌活性研究的报道。故本文通过对菌克软膏和单一成分制剂林可霉素软膏和硝酸咪康唑软膏的体外抗菌活性进行对比研究，为菌克软膏的临床应用提供科学的实验依据。

　　1 材料与试剂

　　1. 1 仪器设备 生物安全柜（ HFsafe1200 型，上海力申科学仪器有限公司） ,净化工作台（ SM-CJ-1FD 型，苏净安泰） ,隔水式恒温培养箱 （ 303-6B型，南通科学仪器厂） ,霉菌培养箱（ MJ-160 型，上海跃进医疗器械厂） ,台式灭菌器（ TMQ. J-2540型，山东新华医疗器械股份有限公司） ,电热恒温鼓风干燥箱（ DHG-9240 型，上海一恒科技有限公司） ,紫外可见分光光度计（ 752N 型，上海精科） ,往复水浴振荡器（ SHA-C 型，金坛市晨阳电子仪器厂） .

　　1. 2 培养基 营养琼脂培养基（ 批号： 140106,杭州天和微生物试剂有限公司） ,沙堡弱琼脂培养基（ 批号： 131216,杭州天和微生物试剂有限公司） .

　　1. 3 试验菌株 细菌： 金黄色葡萄球菌 3 株（ ATCC6538、ATCC43300、ATCC25923） ,大肠杆菌1 株（ ATCC8739） ,枯草杆菌1 株（ ATCC6633） ,铜绿假单胞菌 1 株（ ATCC27853） ; 真菌： 白色念珠菌3 株[CMCC （ F） C1a、CMCC （ F） C1b、CMCC （ F）C1c],热带念珠菌 3 株[CMCC （ F） C2a、CMCC（ F） C2b、CMCC（ F） C2c],红色毛癣菌 3 株[CM-CC（ F） T1a、CMCC（ F） T1g、CMCC（ F） T1h],须癣毛癣菌 3 株[CMCC（ F） T5a、CMCC（ F） T5b、CM-CC （ F） T5c],断发毛癣菌 3 株[CMCC （ F） T4b、CMCC（ F） T4c、CMCC（ F） T4d],犬小孢子菌 3 株[CMCC （ F） M3d、CMCC （ F） M3e、CMCC （ F）M3h],石膏样小孢子菌 3 株[CMCC（ F） M2b、CM-CC（ F） M2c、CMCC（ F） M2d],裴氏着色真菌 1 株[CMCC （ F） D6j],马拉色菌 1 株[CMCC （ F）G4h],均购自中国医学科学院皮肤病研究所。

　　1. 4 试验药物 菌克软膏（ 规格： 含盐酸林可霉素 15 mg /g,硝酸咪康唑 15 mg /g,自制，批号：20140224） ; 林可霉素软膏（ 规格： 含盐酸林可霉素15 mg / g,自制，批号： 20140225） ; 硝酸咪康唑软膏（ 规格： 含硝酸咪康唑15 mg/g,自制，批号：20140226） ,阴性对照软膏（ 自制，批号： 20140227） .

　　2 方法

　　2. 1 活化菌株 细菌用营养琼脂培养基，37 ℃ 培养 1 ~ 3 d.真菌用沙堡弱培养基，28 ℃ 培养 5 ~7 d.

　　2. 2 菌悬液制备 挑取一定量的菌落，溶于 1 mL灭菌蒸馏水，充分混合均匀，在紫外分光光度计上用灭菌蒸馏水调节菌悬液浊度约为0.5 （ OD600） ,相当于 5 ×106CFU / mL.

　　2. 3 含菌平板制备 取直径 9 cm 培养皿，加入融化培养液20 mL,制作成培养基平板。将各菌悬液 150 μL 用玻璃涂布棒均匀涂布于培养基平板表面。

　　2. 4 打孔加药 使用直径 7 mm 的打孔器在涂菌后的培养基上各打 4 个孔，将孔内琼脂挑去后分别将新打开的菌克软膏、林可霉素软膏、硝酸咪康唑软膏和阴性对照软膏挤入孔内，使软膏与孔边缘平齐并充分接触，勿使软膏沾染孔外琼脂平面[3].

　　2. 5 培养条件 细菌置隔水式恒温培养箱 37 ℃培养 3 d,真菌置霉菌培养箱 28 ℃培养 7 d.

　　2. 6 结果观察 观察各软膏孔周围抑菌圈大小并记录其直径（ mm） .抑菌圈直径取最大径和最小径的均数[4].每株菌至少重复 3 次。

　　2. 7 统 计数据 计量资料以珋x ± s 表示，采用SPSS 19. 0 统计软件，应用 One-w ay ANOVA 对数据进行单因素方差分析（ 两组间比较用 LSD 法） ,P < 0. 05 为差异有统计学意义。

　　3 结果

　　3. 1 抗细菌结果 4 种软膏对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌和铜绿假单胞菌的抑菌效果比较见图 1、表 1.

　　对金黄色葡萄球菌标准株抑菌圈直径进行方差分析，得出 F 值为 62. 45 （ P < 0. 01） ,说明 4 种软膏形成的抑菌圈直径比较差异有统计学意义。

　　对 4 种软膏的抑菌圈直径均数用 LSD 法进行两两比较，结果表明，阴性对照软膏分别与菌克软膏、林可霉素软膏和硝酸咪康唑软膏比较，差异均有统计学意义（ P <0. 01） ; 菌克软膏分别与林可霉素软膏、硝酸咪康唑软膏比较，差异有统计学意义（ P <0. 01） .由此可知，各软膏的抑菌圈直径大小顺序： 菌克软膏 > 林可霉素软膏 > 硝酸咪康唑软膏 > 阴性对照软膏。

　　对大肠杆菌、枯草杆菌标准株抑菌圈直径进行方差分析，得出 F 值分别为 616. 23 （ P <0. 01） 、964. 68 （ P < 0. 01） ,表明 4 种软膏形成的抑菌圈直径比较差异有统计学意义。对 4 种软膏的抑菌圈直径均数分别用 LSD 法进行两两比较，结果表明，阴性对照软膏分别与菌克软膏、林可霉素软膏比较，差异有统计学意义（ P < 0. 01） ; 菌克软膏分别与林可霉素软膏、硝酸咪康唑软膏比较，差异有统计学意义（ P <0. 01） .由此可知，各软膏的抑菌圈直径大小顺序： 菌克软膏 > 林可霉素软膏 > 硝酸咪康唑软膏 = 阴性对照软膏。

　　对铜绿假单胞菌标准株抑菌圈直径进行方差分析，得出 F 值为 183. 71 （ P <0. 01） ,说明 4 种软膏形成的抑菌圈直径比较差异有统计学意义。对4 种软膏的抑菌圈直径均数用 LSD 法进行两两比较，结果表明，阴性对照软膏组分别与菌克软膏、林可霉素软膏比较，差异有统计学意义 （ P <0. 01） ; 菌克软膏与林可霉素软膏比较差异无统计学意义（ P >0. 05） ; 菌克软膏与硝酸咪康唑软膏比较差异有统计学意义（ P <0. 01） .由此可知，各软膏的抑菌圈直径大小顺序： 菌克软膏 = 林可霉素软膏 > 硝酸咪康唑软膏 = 阴性对照软膏。

　　硝酸咪康唑软膏对大肠杆菌、枯草杆菌、铜绿假单胞菌的抑菌圈直径为 7 mm,阴性对照软膏对4 种细菌的抑菌圈直径测量值为 7 mm,与打孔器的直径相同，实际上并无抑菌圈，说明硝酸咪康唑软膏对大肠杆菌、枯草杆菌和铜绿假单胞菌均无抗菌活性，阴性对照软膏对 4 种测试细菌也无抗菌活性。

　　3. 2 抗真菌结果 4 种软膏对 9 种试验真菌的抑菌效果比较见图 2、表 2.

　　对各皮肤癣菌标准株抑菌圈直径进行方差分析，得出 F 值为 307. 60 （ P <0. 01） ,表明 4 种软膏形成的抑菌圈直径比较差异有统计学意义。对 4种软膏的抑菌圈直径均数用 LSD 法进行两两比较，结果表明，阴性对照软膏组分别与菌克软膏、硝酸咪康唑软膏比较差异有统计学意义（ P <0. 01） ; 菌克软膏与林可霉素软膏比较差异有统计学意义（ P <0. 01） ; 菌克软膏与硝酸咪康唑软膏比较差异无统计学意义（ P >0. 05） .由此可知，各软膏的抑菌圈直径大小顺序： 菌克软膏 = 硝酸咪康唑软膏 > 林可霉素软膏 = 阴性对照软膏。

　　对各念珠菌标准株抑菌圈直径进行方差分析，得出 F 值为 299. 03 （ P <0. 01） ,表明 4 种软膏形成的抑菌圈直径比较差异有统计学意义。对 4种软膏的抑菌圈直径均数用 LSD 法进行两两比较，结果表明，阴性对照软膏组分别与菌克软膏、硝酸咪康唑软膏比较差异均有统计学意义（ P <0. 01） ; 菌克软膏与林可霉素软膏比较差异有统计学意义（ P <0. 01） ; 菌克软膏与硝酸咪康唑软膏比较差异无统计学意义（ P >0. 05） .由此可知，各软膏的抑菌圈直径大小顺序： 菌克软膏 = 硝酸咪康唑软膏 > 林可霉素软膏 = 阴性对照软膏。

　　对裴氏着色真菌、糠秕马拉色菌标准株抑菌 圈直径进行方差分析，得出 F 值分别为 338. 36（ P <0. 01） 、292. 80 （ P < 0. 01） ,说明 4 种软膏形成的抑菌圈直径比较差异有统计学意义。对 4 种软膏的抑菌圈直径均数分别用 LSD 法进行两两比较，结果表明，阴性对照软膏分别与菌克软膏、硝酸咪康唑软膏比较，差异均有统计学意义（ P <0. 01） ; 菌克软膏与林可霉素软膏比较差异有统计学意义（ P <0. 01） ; 菌克软膏与硝酸咪康唑软膏比较差异无统计学意义（ P >0. 05） .由此可知，各软膏的抑菌圈直径大小顺序： 菌克软膏 = 硝酸咪康唑软膏 > 林可霉素软膏 = 阴性对照软膏。

　　林可霉素软膏、阴性对照软膏对 9 种真菌的抑菌圈直径测量值为 7 mm,与打孔器的直径相同，实际上并无抑菌圈，说明林可霉素软膏、阴性对照软膏对 9 种测试真菌均无抗菌活性。

　　4 讨论

　　菌克软膏、林可霉素软膏、硝酸咪康唑软膏和阴性对照软膏均采用水包油型乳剂型基质。菌克软膏的主药为盐酸林可霉素、硝酸咪康唑及醋酸地塞米松。林可霉素的抗菌机制是与敏感菌核糖体的 50s 亚基结合，抑制肽酰基转移酶的活性，使肽链延伸受阻而抑制细菌蛋白质合成[5].咪康唑的抗菌机制是抑制真菌羊毛甾醇 14α 去甲基化酶（ P45014DM） ,阻滞真菌细胞中羊毛甾醇 14α 位去甲基化反应，达到抑制真菌生长繁殖的目的[6-8].地塞米松为长效糖皮质激素，具有抗炎、抗病毒、抗过敏、免疫抑制等药理作用[9].三药合用有利于拓宽抗菌谱，增强抗菌活性和降低耐药风险，并可减少单一用药的剂量，降低毒副作用和提高临床疗效[10].

　　本试验观察了菌克软膏对 4 种细菌共 6 株标准菌株的体外抗菌活性，并与单一制剂林可霉素软膏、硝酸咪康唑软膏和阴性对照软膏进行平行对照，观察到在抗细菌方面，菌克软膏的抗菌活性等于或者大于林可霉素软膏。尤其在抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及枯草杆菌时，菌克软膏抗菌活性极大于林可霉素软膏，其原因可能是硝酸咪康唑对金黄色葡萄球菌有杀菌性，对大肠杆菌、枯草杆菌有较强的抑菌性（ 但无杀菌性） ,因此盐酸林可霉素与硝酸咪康唑合用有协同作用。而硝酸咪康唑对铜绿假单胞菌无抑菌性，因此盐酸林可霉素与硝酸咪康唑合用无协同作用。

　　本试验观察了菌克软膏对9 种真菌共23 株标准菌株的体外抗菌活性，并与单一制剂林可霉素软膏、硝酸咪康唑软膏和阴性对照软膏进行平行对照，观察到在抗真菌方面，菌克软膏的抗菌活性等于硝酸咪康唑软膏，其对常见皮肤癣菌、念珠菌、裴氏着色真菌、糠秕马拉色菌均有抗菌作用，说明其抗菌谱广，但形成的抑菌圈都很小，说明其对上述真菌的杀菌活性相对较弱。这一试验结果与临床研究结果一致[11-12].

　　综上所述，抗细菌药物、抗真菌药物与糖皮质激素联合制成的菌克软膏主要针对伴有常见细菌感染或者明显炎症反应的湿疹、皮炎、足癣等疾病。本试验观察菌克软膏对常见致病细菌、真菌的体外抗菌活性，是治疗皮肤疾病的关键。直接用软膏避免了用原料药所得药敏结果与临床实际用药效果之间的差距。故菌克软膏可以作为伴有常见细菌感染或者明显炎症反应的湿疹、皮炎、足癣等疾病的治疗药物。

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